實(shí)驗(yàn)細(xì)胞器的分級(jí)分離

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞器的分級(jí)分離第1頁(yè)/共13頁(yè)[目的要求]1．掌握差速離心法和密度梯度離心法的原理。2．熟悉哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體分離和純化的實(shí)驗(yàn)方法。第2頁(yè)/共13頁(yè)[實(shí)驗(yàn)原理]

球形顆粒的沉降速率取決于其密度、半徑、介質(zhì)黏度和離心力。

差速離心法（differentialcentrifugation）是將細(xì)胞勻漿在密度均一的介質(zhì)中從低速到高速離心，較大顆粒先在低速離心時(shí)沉淀，再用高速離心沉淀上清液中的小顆粒物質(zhì)，從而達(dá)到逐級(jí)分離細(xì)胞器的目的。

密度梯度離心法（densitygradientcentrifugation）是一定介質(zhì)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，頂部的細(xì)胞勻漿在重力或離心力場(chǎng)的作用下分層、分離。

一般先通過(guò)差速離心法將細(xì)胞器初步分離，再進(jìn)一步通過(guò)密度梯度離心法分離純化細(xì)胞器。第3頁(yè)/共13頁(yè)

細(xì)胞器的分離常通過(guò)組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三個(gè)步驟完成。

分級(jí)分離方法有兩種，即：差速離心法和密度梯度離心法。第4頁(yè)/共13頁(yè)[實(shí)驗(yàn)用品]1．器具：玻璃勻漿器、低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、天平、普通光學(xué)顯微鏡、1.5mlEp管、載玻片、10ml滴管、冰盒、冰塊、濾網(wǎng)、染缸、20ml燒杯。2．材料：大白鼠。3．試劑：生理鹽水、PBS、0.25mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基綠-派洛寧染液、丙酮、0.2％的詹納斯綠B。第5頁(yè)/共13頁(yè)[實(shí)驗(yàn)步驟]1．組織勻漿制備（1）取材將空腹12～24h的大鼠處死。剖開(kāi)腹部，迅速取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血污，用濾紙吸干。（2）制備勻漿稱取約1～2g左右的肝組織，用預(yù)冷的0.25mol/L的蔗糖溶液沖洗數(shù)次，剪碎。以預(yù)冷的0.25mol/L的蔗糖溶液懸浮剪碎的組織，移入勻漿器內(nèi)，在冰浴條件下勻漿。勻漿完成后，用濾網(wǎng)過(guò)濾，即制得肝細(xì)胞勻漿，備用。第6頁(yè)/共13頁(yè)2.細(xì)胞器的分級(jí)分離(1)細(xì)胞核的分離：第一次:1000rpm,8min。(2)細(xì)胞核的純化在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2至2ml，混懸。用長(zhǎng)針頭注射器在混懸液下輕輕加入2ml的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。2000rpm離心8min。加0.25M蔗糖至4ml，混勻第二次:1300rpm,8min。棄上清上清保留于Ep管1.0處第7頁(yè)/共13頁(yè)顯微鏡下觀察結(jié)果(3)細(xì)胞核鑒定：

。分色:快速放入丙酮中，蒸餾水漂洗，擦干水分固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干染色：滴加甲基綠-派洛寧染液染色15min涂片：在離心后的沉淀中加入幾滴PBS，混勻后涂片，空氣干燥第8頁(yè)/共13頁(yè)(4)線粒體的分離

將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清以10000g離心10min，將上清移入1.5mlEp管內(nèi)待用。沉淀用0.25mol/L的蔗糖溶液重懸后，

10000g離心10min，取沉淀。

第9頁(yè)/共13頁(yè)(2)線粒體的鑒定

于潔凈載玻片上滴1滴0.02％～1％的詹納斯綠B染液，用牙簽挑取線粒體沉淀均勻涂于染液中，染色5～10min，蓋上蓋玻片，鏡檢。第10頁(yè)/共13頁(yè)[結(jié)果與分析

光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核經(jīng)甲基綠-派洛寧染色，DNA呈藍(lán)綠色，核仁和胞質(zhì)RNA呈紅色。觀察分析完整細(xì)胞核的數(shù)量及其比例。線粒體經(jīng)詹納斯綠B染色呈亮綠色。第11頁(yè)/共13頁(yè)[注意事項(xiàng)]1．組織勻漿時(shí)，既要盡可能使細(xì)胞完全破碎，又要盡量快速。2．在細(xì)胞器分離過(guò)程中，所有操作應(yīng)盡可能在1～4℃下進(jìn)行。3．實(shí)