細(xì)胞工程第五章

第四章細(xì)胞融合與單克隆抗體第一節(jié)細(xì)胞融合及其方法一、細(xì)胞融合（cellfusion）的定義又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridization）或細(xì)胞雜交（cellhybridization），是指在離體條件下用人工方法將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。分為自發(fā)細(xì)胞融合和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。（一）自發(fā)細(xì)胞融合（spontaneouscellfusion）

指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象?！趔w內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合

可以在受精過程、個(gè)體內(nèi)的肌管形成、胚胎著床、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成、腫瘤細(xì)胞的融合等過程中觀察到。（二）誘導(dǎo)細(xì)胞融合（inducedcellfusion）

指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。

人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類：同核體（homokaryon）：由同一基因型親本細(xì)胞融合而來。異核體（heterokaryon）：由不同基因型親本細(xì)胞融合而來。生物法、物理法、化學(xué)法

二、細(xì)胞融合的主要過程細(xì)胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場作用下凝聚，彼此靠近；兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜相互融合；質(zhì)膜上的受體、糖蛋白等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上重新分布；細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合；細(xì)胞核融合，形成融合細(xì)胞。細(xì)胞橋的形成：細(xì)胞膜磷脂分子擾動(dòng)出現(xiàn)通道（一）親本細(xì)胞的制備1、對(duì)于植物和微生物細(xì)胞的融合必需先制備原生質(zhì)體。2、動(dòng)物單細(xì)胞可以直接用于細(xì)胞融合。（二）誘導(dǎo)細(xì)胞融合◆1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)日本血凝性病毒引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。

◆20世紀(jì)70年代初，高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合?！?0世紀(jì)80年代，齊默曼等建立電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。細(xì)胞A細(xì)胞B雜交細(xì)胞生物法化學(xué)法物理法人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺(tái)病毒化學(xué)誘導(dǎo)：PEG、Ca2+、溶血卵磷脂等物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)衣殼粒(capsomer)衣殼(capsid)核髓(genome)被膜(envelope)刺突(spike)核衣殼

病毒的磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。機(jī)制主要是病毒表面刺突的神經(jīng)氨酸酶的作用。當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞之間時(shí)，神經(jīng)氨酸酶降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集在病毒周圍，在高pH和Ca+條件下局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙臺(tái)病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。在高Ca2+和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高pH、高濃度Ca2+誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。優(yōu)點(diǎn)：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：融合過程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。3、物理法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合。（三）篩選融合細(xì)胞細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。◆問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的細(xì)胞嗎？☆

A-B（非同源細(xì)胞融合體），A-A，B-B（同源細(xì)胞融合體）?！?/p>

A-A-A，B-B-B，A-A-B，B-B-A等多核體（含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體）。☆未融合的A，B。篩選的基本原理是通過培養(yǎng)和篩選，把融合體從同核體以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞中分離出來。篩選的方法◆非選擇性篩選：利用雜交細(xì)胞生長比親本細(xì)胞快的現(xiàn)象，用機(jī)械的方法（如毛細(xì)管吸取法）把單個(gè)雜交細(xì)胞挑選出來，分裂繁殖，培養(yǎng)出細(xì)胞克隆。◆選擇性篩選：根據(jù)細(xì)胞對(duì)藥物的抗性、營養(yǎng)要求或溫度敏感性等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來。常用方法有：抗藥性篩選；營養(yǎng)缺陷型篩選；溫度敏感型篩選等。第二節(jié)單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)思考？1、抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？2、抗體如何產(chǎn)生？3、用傳統(tǒng)的方法如何獲得抗體？抗體是由B細(xì)胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)?？贵w分子：由四條肽鏈所組成，兩條重鏈（H鏈）和兩條輕鏈（L鏈）。利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用細(xì)胞融合技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞。利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡——短命細(xì)胞。（一）B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性◆B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)：一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵◆骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株——沒有抗體分泌物。細(xì)胞融合技術(shù)脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命1984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)二、雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology）定義用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)。雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力，通過克隆化培養(yǎng)獲得純的細(xì)胞可以生產(chǎn)高純度的單克隆抗體。1、提取細(xì)胞并培養(yǎng)2、細(xì)胞融合B淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞B淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞

3、獲得的雜交細(xì)胞（繼承雙親的特點(diǎn)）檢驗(yàn)和篩選4、雜交細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)5、得到化學(xué)性質(zhì)單一的，針對(duì)性強(qiáng)的抗體培養(yǎng)基篩選◆

B淋巴細(xì)胞的獲得經(jīng)特定抗原免疫的能產(chǎn)生目的抗體的動(dòng)物淋巴細(xì)胞；免疫動(dòng)物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近的親源關(guān)系。如：鼠－鼠雜交瘤細(xì)胞；人鼠或鼠兔雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定。三、單克隆抗體的制備過程（一）親本細(xì)胞的選擇一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫(向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體)、加強(qiáng)免疫(向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體)三個(gè)過程。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。◆骨髓瘤細(xì)胞的獲得

骨髓瘤細(xì)胞：需同時(shí)具有兩個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞系不能分泌抗體，否則雜交瘤細(xì)胞將分泌混合抗體；要選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-

）。骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。（二）雜交細(xì)胞融合PEG誘導(dǎo)法：將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按1:4～1:10，一般為1:5混合，并加入PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合，混合時(shí)間在１min內(nèi)。30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100μL／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。

細(xì)胞分裝：混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，濃度為２×105細(xì)胞/0.1mL培養(yǎng)基，５~6天出現(xiàn)新細(xì)胞克隆。將不完全培養(yǎng)基加入融合細(xì)胞的過程要小心謹(jǐn)慎。細(xì)胞在離心和高濃度PEG作用下皺縮并呈現(xiàn)交融狀態(tài)，加入不完全培養(yǎng)基時(shí)大量水分涌入使細(xì)胞很快膨脹，若加入液體過快過多，細(xì)胞可能會(huì)因此崩解而導(dǎo)致融合失敗。沒融合的淋巴細(xì)胞6-10天死亡雜交瘤細(xì)胞沒融合的骨髓細(xì)胞如何選擇？

(三）融合細(xì)胞的篩選HAT培養(yǎng)基篩選DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)H,

次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的HGPRT與TK，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。（四）分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選——ELISA方法檢測抗體

雜交瘤抗體檢測

抗原結(jié)合法第二抗體法ELISA法檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（五）雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)

一旦檢測到分泌目標(biāo)抗體的克隆，應(yīng)及時(shí)將陽性克隆轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并盡快進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。目的是利用單個(gè)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)從細(xì)胞群體中選育出遺傳穩(wěn)定的能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，淘汰非特異性的或遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。及早進(jìn)行，以免無關(guān)克隆過度生長。常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法通常用“有限稀釋法”來選擇：將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～5次，直至得到基因型和表型穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。

單細(xì)胞克隆培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞處于不利于生長的環(huán)境（大量非融合細(xì)胞或同核體融合細(xì)胞死亡），在培養(yǎng)孔中加入飼養(yǎng)層細(xì)胞可提高克隆效率。飼養(yǎng)層細(xì)胞（feedercell）可釋放某些生長刺激因子到培養(yǎng)液中，促進(jìn)了雜交瘤細(xì)胞生長，并能滿足雜交瘤對(duì)生長密度的需要，從而提高雜交瘤細(xì)胞存活率。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞等。問題：整個(gè)制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞，但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞。第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。（六）大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：◆動(dòng)物接種法◆轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法◆細(xì)胞培養(yǎng)罐法培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c四、單克隆抗體的應(yīng)用

與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。1、提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復(fù)性。2、臨床診斷：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速性傳播疾病、血型、懷孕或排卵、癌（早期癌抗原的檢測）3、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤。

小結(jié)細(xì)胞融合的定義、原理與方法融合細(xì)胞的篩選方法：雜交瘤細(xì)胞的篩選方法單克隆抗體的制備流程單克隆抗體制備視頻：課堂測驗(yàn)（三）

鼠源性單克隆抗體仍帶有鼠抗原決定簇而使其應(yīng)用具有局限性。例如注射到人體內(nèi)引起人抗鼠反應(yīng)、過敏反應(yīng)、抗體很快被清除、不能有效激發(fā)免疫防御系統(tǒng)等問題?，F(xiàn)在的目標(biāo)是獲得低免疫原性、高效性的人源化單克隆抗體。課后問題：查閱文獻(xiàn)論述人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展。知識(shí)回顧培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c第五章動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立1907年，胚胎學(xué)家Harrison在無菌條件下，用蓋玻片懸滴培養(yǎng)法將蛙胚髓管部組織在體外培養(yǎng)了數(shù)周，開創(chuàng)了動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的先河。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1、培養(yǎng)器材的發(fā)展

2、培養(yǎng)方法的發(fā)展◆雙蓋片懸滴培養(yǎng)法◆旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法◆灌注小室培養(yǎng)法方便了更換培養(yǎng)液的操作，大大降低了污染的概率培養(yǎng)物可交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織成長

供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出，從而使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中

3．培養(yǎng)液的發(fā)展天然培養(yǎng)基(胎汁、血漿和血清)人工合成培養(yǎng)基（需添加血清）無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長因子替代血清）3、培養(yǎng)液的發(fā)展天然培養(yǎng)基(胎汁、血漿和血清)人工合成培養(yǎng)基（需添加血清）無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長因子替代血清）第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概述（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的概念

指在人工條件（除滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，還要進(jìn)行pH和溶解氧的最佳控制）下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。

（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1、生產(chǎn)疫苗目前，通過動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的疫苗產(chǎn)品有口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗等。2、生產(chǎn)干擾素3、生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物4、生產(chǎn)人源化單克隆抗體（三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程1—組織塊；2—組織塊碎片；3—消化；4—離心；5—原代培養(yǎng)；6—傳代培養(yǎng)；7—液氮罐保存細(xì)胞；8—復(fù)蘇培養(yǎng)；9—擴(kuò)大培養(yǎng)；10—大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長增殖的培養(yǎng)方法?！糁饕糜诜琴N壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞?！糍N壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)?！魬腋∨囵B(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧效果比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可以借鑒許多細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)?！魬腋∨囵B(yǎng)的缺點(diǎn)：不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞密度較低，另外只有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。攪拌式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器2、貼壁培養(yǎng)指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。其中微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。◆貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例、適用于所有類型細(xì)胞?！糍N壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長。3

2

旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)14

中空纖維培養(yǎng)

細(xì)胞工廠培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)（1）旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動(dòng)，細(xì)胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。細(xì)胞在體內(nèi)、體外的生存空間：存在差異三維空間，高密度生長

二維空間，單層生長，生長密度低體內(nèi)體外（2）中空纖維培養(yǎng)中空纖維培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)血管”即中空纖維來為細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件。

中空纖維是細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，水分子、小分子營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以通過。管壁表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞能在上面貼壁生長。細(xì)胞接種到中空纖維的外表面，而充氧的培養(yǎng)液灌流到中空纖維的內(nèi)腔。貼附在外表面的細(xì)胞吸取內(nèi)腔滲出的營養(yǎng)，迅速生長繁殖。一段時(shí)間后細(xì)胞占據(jù)中空纖維外壁所有空間，并在纖維表面堆積。（3）細(xì)胞工廠培養(yǎng)由一組長方形培養(yǎng)小室組成。(a)向培養(yǎng)室內(nèi)灌注培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在各培養(yǎng)小室之間流動(dòng)；(b)細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)動(dòng)90。，每個(gè)培養(yǎng)小室液體被分隔，氣相仍到達(dá)各個(gè)培養(yǎng)小室；(c)向下放平，封閉入口，或者連接到5％CO2通氣管上（4）微載體培養(yǎng)微載體（Microcarrier）：是直徑60-250μm的適用于貼壁依賴型細(xì)胞生長的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。

微載體培養(yǎng)是在培養(yǎng)容器內(nèi)加入培養(yǎng)液及對(duì)細(xì)胞無害的顆?！⑤d體，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著并呈單層生長繁殖，通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)的培養(yǎng)方法。微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求，又能充分利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間。良好微載體的特點(diǎn)：1、好的生物相容性：無毒無害；2、好的黏附性：適于細(xì)胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷；3、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一；4、良好的傳質(zhì)性能；5、強(qiáng)的機(jī)械性能：保護(hù)細(xì)胞、重復(fù)利用；6、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長的主要環(huán)節(jié)有哪些？1、潛伏期：（1）游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)。（2）吸附期：不同類型的細(xì)胞貼壁時(shí)間有所差異。2、對(duì)數(shù)生長期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片，出現(xiàn)接觸性抑制。3、停滯期：細(xì)胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。如不及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞脫落死亡。知識(shí)點(diǎn)回顧微載體培養(yǎng)的操作過程：微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞也經(jīng)過以上四步。大致可以分為五個(gè)階段，即培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、細(xì)胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大階段。培養(yǎng)初期階段：保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的pＨ和溫度，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種至1/3體積的培養(yǎng)基中。黏附貼壁階段：緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。維持培養(yǎng)階段：隨細(xì)胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。經(jīng)過3天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。細(xì)胞收獲階段：排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗1次，加入酶，快速攪拌，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大階段：增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1、表面積／體積大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高。2、把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)。3、可用簡單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長情況。4、培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間??；勞動(dòng)強(qiáng)度??；放大容易，使大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞成為可能。5、接種與收獲方便，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率較高。微載體培養(yǎng)的缺點(diǎn)：細(xì)胞生長在微載體表面，培養(yǎng)過程中連續(xù)攪拌會(huì)損傷微載體表面的細(xì)胞，而且培養(yǎng)后期細(xì)胞容易從微載體上脫落下來。為克服傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的不足，現(xiàn)開發(fā)出大孔微載體。大孔微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細(xì)胞在其內(nèi)部生長，保證細(xì)胞充分的生長空間，使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，增加細(xì)胞貼壁的穩(wěn)定性。3、固定化培養(yǎng)將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。具有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法。（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1、分批式培養(yǎng)2、流加式培養(yǎng)3、半連續(xù)式培養(yǎng)4、連續(xù)式培養(yǎng)5、灌注