RAW2647小鼠巨噬細胞protocol

RAW264、7細胞株得相關信息ATCC:美國模式培養(yǎng)物集存庫(Americantypeculturecollection)得簡寫收到冷凍管細胞得處理方式1。1。收到細胞株包裹時,請檢查細胞株冷凍管就是否有解凍情形,若有請立即通知。細胞株于–70℃,隔夜后,移到液氮)。2。2。收到T25flask細胞得處理方式?于寄送過程中,為避免起泡造成細胞脫落死亡,T25有無污染現(xiàn)象,若有任何問題,不要打開蓋子,請立即通知細胞實驗室。T25flask靜置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,使細胞回溫至37℃,并讓運送過程中少數脫落得細胞可再附著生長。k僅留約5—10ml培養(yǎng)基于flask內,依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中,或細胞已長滿盤,則將細胞做傳代培養(yǎng)。一、RAW264、7細胞培養(yǎng)得特點RAW可呈多突形。細胞核為圓形或橢圓形,較深。貼壁特別牢固。2、RAW264。7具有很強得吞噬能力,當吞噬抗原后,細胞會釋放趨化因子,進一步促進細胞伸出偽足,增強粘附攀爬能力。細胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣都會促進該細胞呈現(xiàn)梭形、長梭形,鏡下會瞧到具有細長偽足得小細胞被類似上皮得梭形大細胞取代。3、每次傳代都很難消化下來。用力過大則對細胞損傷較大,這種細胞傳代時接種密度要大,否則容易使巨噬細胞向終末細胞分化,細胞變成長形,并且不能回復,這就是培養(yǎng)這種細胞時4、對于RAW264.7細胞她得聲場時喜歡結伴。正常生長狀態(tài)應該就是一小片一小片得生長,片片之間不連接,等到長到更多更密得時候會連成大片,并且會疊加成層、所以,要很好地控制好細胞得生長速度,不要等到疊加成層得時候再傳代。RAW短,半小時就能貼很多,剛貼壁就是細胞呈圓形,折光度很好,鏡下觀察如小珍珠狀一個個地散落于瓶底面、生長一段時間后,部分細胞會變成類似四老化掉、1)將培養(yǎng)瓶內舊得培養(yǎng)液棄掉,然后用D－Hanks液洗兩次,(一定要洗干凈,以免影響胰酶得消化酶得消化作2)加入0。25%胰酶-EDTA消化,25cm培養(yǎng)瓶加0。4ml,37度消化5min,鏡下瞧到細胞變3)立即加含10%FCS得培養(yǎng)液終止消化,用細胞刮刀輕刮,注意,這時候用吸管吹不下來,但就是刮刀卻很容易刮下來,而且對細胞得損傷極小4)離心,棄上清,加新得培養(yǎng)液(10％FCS),小心吹勻,分裝入新得培養(yǎng)瓶1.配制凍存培養(yǎng)液;(通用得為培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1,但其中得血清可進行調整,2、取對數生長期得細胞(凍存前一天換液),用胰蛋白酶把單層生長得細胞消化下來,4、去除胰蛋白酶及舊得培養(yǎng)液,加入適量配制好得凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節(jié)凍存液中細胞得最終密度為5×106/ml~1×107／ml;5.將細胞分裝入凍存管中,每管1~1、5ml(不超過凍存管容量得80%);6、在凍存管上標明細胞得名稱,凍存時間及操作者;7。凍存:標準得凍存程序為降溫速率-1~—2℃/min;當溫度達-25℃以下時,可增至—5℃~－10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞得凍存管放入－2h、(具體操作為4°C20min,-20°C30min,—70℃過夜,轉入液氮中)in2。從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻;4。棄去上清液,加入含10％小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);(復蘇時細胞密度稍大,可提高復蘇效率)胞狀1。倒掉舊得培養(yǎng)基,加入3ml新得培養(yǎng)基(有無血清得都可)洗滌一次,用滴管吸走,然ml得培養(yǎng)基,進行預吹打,控制吹打力度,輕輕地大概沿著瓶底過一遍,然后吸走。這時侯再開始正式得消化、吹打。2。把吹打下來得細胞懸液加入到新得培養(yǎng)瓶內,培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)擇一個時間點,已經有部分細胞貼壁得情況下,重新置于潔凈臺,底面朝上迅速倒出其中得培養(yǎng)基,加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細胞生長情況以及形態(tài)。我稱之為“二傳”。不明之處:培養(yǎng)之前,一切與細胞接觸得玻璃器皿與器具都要進行過去熱源處理。(200－25RAW264.7細胞株CellCulture得材料(一)儀器1.凈化工作臺(二)玻璃器皿(三)塑料器皿2.槍頭6、凍存管(1~2ml)(四)其她物品2.紅血球計數板4.醫(yī)用橡皮膏5.移液槍試劑4.雙抗(青霉素、鏈霉素)7.DMSO(分析純)或無色新鮮甘油級胎牛血清1、?Hyclone得特級胎Hyclone特級胎牛血清(DefinedFBS),貨號SH30070,就是世界上唯一含量≤10EU/ml,血紅蛋白含量≤10mg/dl。?此血清可以廣泛用于各種細胞培養(yǎng),2、Gibco得特級胎牛血清稍次一點得就是Gibco公司在美國原裝生產得特級胎牛血清,這款血清,貨號就是16000—044,就是100nm過濾3次,內毒素與血紅蛋白含量都可以與。家生物行業(yè)類得著名供應商,成立于1978年,大部分血清得采集與加工都在加利FDA證得cGMP血源來自北美與澳大利亞BioInd公司得生產完全符合GMP得要求,并通過lIndustries主營細胞培養(yǎng)類產品,BioInd工廠加工得胎牛血清均符合USDA標準及歐洲標準血清。根據美國農業(yè)部標準,原始血清均采自未發(fā)生瘋牛病(BSE)與口蹄作臺都通過高效微?？諝膺^濾器過濾,并保持正壓分裝環(huán)境要對總微粒、懸浮微得質量1.Hyclone得加拿大優(yōu)等胎牛血清?性價比最高得就是Hyclone加拿大優(yōu)等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396。03血清采自加拿大,由hyclone公司總部得員工采集加工,采集方法,加工過程,檢定標準與美國原產優(yōu)等胎牛血5EU/ml,血紅蛋白含量≤25mg/dlHyclone級別測依據美國藥典(USP)與美國聯(lián)邦法規(guī)第九篇(9CFR),內毒素含量≤10EU/ml,血紅蛋白含量≤20mg／dl,完全符合美國HyClone＆reg;優(yōu)等胎牛血清得此胎牛血清屬于澳大利亞生產得,不在疫區(qū),可以正常報關進口,目前沒有受到任何影響,所以,就目前而言,算就是最好得胎牛血清了,有不少客戶都此血清來培養(yǎng)大利亞胎牛血清差不多,市場價也就是2300元/500ml左右。這一級別得血清,也第三類,一般級別得進口胎牛血清、?1Hyclone得南美胎牛血清目前,市場上用得最多得Hyclone血清就是南美胎牛血清(FBS)SV30087,此,根據中國商標法得規(guī)定標貼中文標簽,內毒素含量≤10EU／ml,血紅蛋白含量≤20mg/d、?此血清廣泛用于各種腫瘤細胞得培養(yǎng),還沒有資料記載能夠用于干細胞,也聽說有少數人用于干細胞培養(yǎng)得,不過,因為本身血紅素比較高,所以,最好不要用于干細胞,mGemini血清4、TCB得胎牛血清5、?PAA得胎牛血清進行過濾分裝。普普通液體培養(yǎng)基列表BME培養(yǎng)基(BasalMediumEagle)高糖,不含L－谷氨酰胺與丙酮酸鈉。Medium)●●●●●SH30081.02500ml500ml6x500ml6x500ml1000ml0ml20L袋裝ml2－8°C高糖,含L－谷氨酰胺,不含酚紅與丙酮酸鈉。高糖,含丙酮酸鈉,不含L－谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。高度改良,含丙酮酸鈉、25mMHEPES,不含L－谷氨酰胺。g含2。50mML－谷氨酰胺、15mMHEPES。含HEPES,不含L-谷氨酰胺?！馭H30243。02●SH30243.LS○SH30243。04●SH30284、01●SH30285、FSSH585、02SH○SH30563。02○SH30607。01●SH30021.02●SH30023、FS●SH30023、02●SH30126、FS6x500ml10L袋裝20L袋裝1000ml1000ml1000mll1000mlx000ml500ml1000ml500ml1000ml500ml1000ml1000mlml2—8°C2－8°C2－8°C●SH30271.01500ml2—8°C含L-谷氨酰胺,不含HEPES。含L－谷氨酰胺,不含HEPES、酚紅。Ham”s培養(yǎng)基(Ham’sNutrientMixture)Grace”s無添加劑培養(yǎng)基TNM-FH培養(yǎng)基●SH30026、FS○SH30526、026x500ml500mlml500mlmlml1000ml500ml2－8°C2-8°C2—8°C2－8°C2-8°CIMDM培養(yǎng)基(Iscove"sModifiedDulbecco＂sMedium)含L-谷氨酰胺、HEPES,不含α-硫代甘油。Leibovitz培養(yǎng)基(LeibovitzMedium)HBSS＊,含L－谷氨酰胺。McCoy"s5A培養(yǎng)基(McCoy"s5AMedium)●SH30228、01BSH01●SH30525.01●SH30253、01B○SH30233、02500ml500ml1000ml500ml1000ml500mlx5001000ml2—8°C2—8°C2－8°C2－8°C含L-谷氨酰胺、HEPES、MEM培養(yǎng)基(MinimumEssentialMedium)EBSS＊,不含L－谷氨酰胺?！馭H30024。02●SH30244。01500ml2—8°CC500ml2-8°C6x500m2－8°Clx1000ml2-8°C500ml2－8°C500ml2—8°C6x5002-8°CmlHB6x1000500ml6x500ml●SH30568。01500ml2-8°C○SH30568、021000ml2-8°CRichter”s改良型,含L—谷氨酰胺、酚紅。SHml8°CRPMI1640培養(yǎng)基(RPMI1640Medium)1X,含2、05mML—谷氨酰胺(同SH30091)。500ml2－8°C2－8°C11X,含2.05mML－谷氨酰胺(同SH30027)。20L袋裝2—8°C10L袋裝2—8°C500ml2－8°C●SH30096.FS2－8°Cl●SH3