第五章目的基因的獲取詳解演示文稿

第五章目的基因的獲取詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五優(yōu)選第五章目的基因的獲取現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五已知基因的獲取方法：⒈PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⒉化學(xué)方法人工合成目的基因現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五未知基因的獲得途徑：⒈構(gòu)建基因組文庫(kù)利用鳥槍法克隆目的基因2.構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的基因3.mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因4.酵母雙雜交體內(nèi)鑒定基因現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五本章內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA的片斷化

第二節(jié)基因的化學(xué)合成第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增第四節(jié)目的基因的分離和擴(kuò)增

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五第一節(jié)基因組DNA的片斷化二、限制性內(nèi)切酶消化法一、

機(jī)械切割法現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五一.機(jī)械切割法（1）超聲波斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷（3）移液器抽吸法現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五二、限制性內(nèi)切酶消化法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切基因組DNA現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五1.優(yōu)點(diǎn)

如果帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接，連接效率高現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五2.缺點(diǎn)①目的基因內(nèi)部可能有內(nèi)切酶的切點(diǎn)BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五②消化的片斷分子量太大或太小不符合載體容量，不能克隆解決的辦法采用隨機(jī)片斷化制備DNA的克隆片斷現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五3.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度限制性內(nèi)切酶的選用原則現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五1）4bp的內(nèi)切酶平均每4096（46）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每256（44）bp一個(gè)切點(diǎn)隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五文庫(kù)：是指一種全體的集合。通過克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物、組織、器官或細(xì)胞類型的所有DNA片段而構(gòu)成的克隆集合體。

克隆并不是為了保存，而是為了分離。

第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增一、基因文庫(kù)（genelibrary）1.基因文庫(kù)現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五為什么要建基因文庫(kù)？高等生物的基因組DNA十分復(fù)雜，單個(gè)基因在基因組或某個(gè)特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定的未知基因非常難的，必須構(gòu)建基因文庫(kù)，利用文庫(kù)篩選技術(shù)獲得該基因的陽(yáng)性克隆，然后對(duì)其進(jìn)行分析?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五基因文庫(kù)的分類基因組文庫(kù)：提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列。cDNA文庫(kù)：mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列推導(dǎo)出來?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五mRNA結(jié)構(gòu)圖DNA結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五2.基因文庫(kù)的構(gòu)建載體的制備DNA的提取及片段化、cDNA的合成載體與插入片段的連接

重組DNA分子導(dǎo)入宿主菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中繁殖保存和擴(kuò)增。二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建1.基因組文庫(kù)理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五篩選目的基因現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五目前常用的載體2.載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少對(duì)載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五（1）λ噬菌體載體最常用

插入型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，通常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位于λ噬菌體DNA非必需區(qū)的單一酶切位點(diǎn)，以供外源基因片段的插入，插入片段適宜長(zhǎng)度約為9kb。

替代型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，需要將非必需區(qū)兩邊的臂進(jìn)行分析純化，才能用于連接，插入片段適宜長(zhǎng)度約為9～22kb。現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五（2）黏粒載體不僅能克隆和增殖完整的真核基因，還可克隆和分析組成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。構(gòu)建過程與噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建過程相似。（3）YAC、BAC載體克隆大片斷DNA的載體?？捎脕砜寺⊥暾膭?dòng)物基因。在人類基因組計(jì)劃中，YAC被廣泛地用于大規(guī)?；蚪M結(jié)構(gòu)分析?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五最早用于基因克隆的載體。只能容納比質(zhì)粒分子量更小的片段。不能用于核基因組文庫(kù)。適合于短序列的克隆文庫(kù)。葉綠體DNA文庫(kù)、線粒體DNA文庫(kù)、cDNA文庫(kù)。（4）質(zhì)粒載體現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五3.基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟（1）基因組DNA的提取關(guān)鍵:制備高分子質(zhì)量的基因組DNA經(jīng)典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白質(zhì)，并用透析法去除分子質(zhì)量雜質(zhì)。在提取時(shí)必須盡可能地避免機(jī)械切割現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五關(guān)鍵：斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接（2）DNA克隆片段的制備超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷②酶切法：現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五（3）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N:所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫(kù)的大小以及從中獲得特定序列的概率的計(jì)算公式：現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大??；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五5.基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及保存（1）基因組文庫(kù)的擴(kuò)增①液體培養(yǎng)增殖法最簡(jiǎn)便混合培養(yǎng)方法：從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-80℃儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）缺點(diǎn)：由于細(xì)菌在液體中以混合群體的形式生長(zhǎng)和不同克隆生長(zhǎng)速率的差異，導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五384孔板現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五②影印濾膜培養(yǎng)法失真最小，最麻煩用包裝后的噬菌體顆粒感染細(xì)菌，并讓細(xì)菌在硝酸纖維素膜上生長(zhǎng)，然后將濾膜上的文庫(kù)影印到其他濾膜上，以供篩選和低溫（-80℃）保存。③制備已包裝的轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物適用于粘粒文庫(kù)，轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物可以在低溫下長(zhǎng)期保存。現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五（2）基因組文庫(kù)的保存小包裝，方便，避免反復(fù)凍融噬菌體一類的基因文庫(kù)：密封，加入少許氯仿，在4℃冰箱內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間地保存（6個(gè)月），低溫冰箱可保存數(shù)年?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五500kb50-300kb現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五100-300kb，濃縮產(chǎn)物濃度達(dá)到100ng/ul現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五三、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)：是指某種生物體某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性，具有時(shí)效性。為什么要構(gòu)建cDNA文庫(kù)？真核生物的基因組DNA龐大且含有大量的重復(fù)序列，難以分離到目的基因片段?，F(xiàn)在是47頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物2.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)（1）不含內(nèi)含子序列（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因（時(shí)效性）（4）比基因組DNA文庫(kù)小得多，容易構(gòu)建現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五3.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五（1）mRNA的來源特點(diǎn)：多數(shù)基因的表達(dá)具有不同程度的組織特異性和發(fā)育階段性。

選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。高豐度：當(dāng)特定的mRNA在細(xì)胞總mRNA群體中所占比例達(dá)到50～90％時(shí)。低豐度：當(dāng)上述比例小于0.5％時(shí)?，F(xiàn)在是51頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300個(gè)A組成的polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化纖維素柱層析法現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五③mRNA的長(zhǎng)度哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為500-8000bp，大部分mRNA位于?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。a.OligodT引導(dǎo)合成法從3’-開始，無法到達(dá)5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－DNA雜交分子現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五mRNA現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五b.隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法合成6～10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸短片段，作為合成第一鏈cDNA的引物。隨機(jī)引物可用于合成特長(zhǎng)的mRNA分子5’mRNA3’現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板RNaseH現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成自我引導(dǎo)合成法現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH（置換合成法）小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期五mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’