農(nóng)殘分析可見紫外分光光度法

農(nóng)殘分析可見紫外分光光度法第1頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）光的微粒性——普朗克公式光作為輻射能又具有微粒性的特征。所謂微粒性，即指光是由光量子（或光子）的一種粒子組成。光輻射的能量是一份一份的。單個(gè)光量子的能量與波長(zhǎng)的關(guān)系可用普朗克（plank）公式表示

式中：E——能量；

h——普朗克常量從公式可見，光量子的波長(zhǎng)與其能量成反比，波長(zhǎng)愈長(zhǎng)，能量愈小。（三）可見紫外、紅外光區(qū)的劃分根據(jù)電磁波具有波粒二重性的特點(diǎn)，可把自然界存在的各種電磁波按波長(zhǎng)順序排列成譜，稱為電磁波譜，如表6－1所示。第2頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第3頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

可將電磁波波長(zhǎng)劃分為若干波段區(qū)域各波段能量不同，引起物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的形式亦不同。物質(zhì)吸收紫外光和可見光則引起分子中價(jià)電子的躍遷；物質(zhì)吸收紅外光則引起分子振動(dòng)，因此可見紫外光譜又稱為電子光譜，紅外光譜又稱為分子振動(dòng)光譜。本章討論可見及紫外分光光度法，由于可見紫外吸收光譜是由電子躍遷產(chǎn)生的，因此波長(zhǎng)為100－800nm的光線才有足夠的能量引起電子躍遷。

分為三個(gè)區(qū)域:100－200nm遠(yuǎn)紫外區(qū)

200－400nm近紫外區(qū)

400－800nm可見光區(qū)域。第4頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、可見紫外分光光度計(jì)

分光光度法使用的儀器是分光光度計(jì)。分光光度計(jì)的種類很多，其儀器結(jié)構(gòu)的主要部件都是由光源、分光系統(tǒng)（單色器）、吸收池、檢測(cè)器和記錄儀所組成。見圖6－1。第5頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第6頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）光源

在可見紫外分光光度計(jì)上常用的光源是鎢絲燈和氫弧燈(或氘燈)

可見光區(qū)用鎢絲白熾燈，其波長(zhǎng)在320－2500nm之間。紫外光區(qū)用氫弧燈或氘燈，其波長(zhǎng)在180－375nm。用氫燈或氘燈作為光源，燈管上必須裝有石英窗（因玻璃對(duì)紫外光有吸收）。第7頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）單色器單色器是指能將不同波長(zhǎng)的入射光分散為單色光的裝置，主要由透鏡（聚焦作用）、輸入輸出狹縫（阻擋不需要的光）和散射裝置（把白色光散成不同波長(zhǎng)的光，是一種分辨器）組成。散射器是單色器的核心，由棱鏡或衍射光柵組成。玻璃棱鏡只能用于可見光區(qū)；石英棱鏡或反射光柵可用于紫外、可見及近紅外光區(qū)。棱鏡的色散原理：不同波長(zhǎng)的光在玻璃或石英中的折射率不同，波長(zhǎng)短的光折射率大，波長(zhǎng)長(zhǎng)的光折射率小，當(dāng)平行的混合光經(jīng)過棱鏡后，就會(huì)使不同波長(zhǎng)的光按次序偏折分開，而成光譜。其光波由紫外線到長(zhǎng)波方向越來越密。第8頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

光柵的色散原理：光柵是在石英或玻璃表面上刻劃許多等距離的平行線，大約每2.45cm刻15000－30000條線?？叹€處不透光，光只能在兩條刻線中間的平面處透過去。這些平面形成極微小的縫，光透過小縫時(shí)即產(chǎn)生繞射現(xiàn)象。較長(zhǎng)的光波偏折的角度大，較短的光波偏折角度小。從棱鏡或光柵射出的光經(jīng)旋轉(zhuǎn)反射鏡就可依次射出狹縫，經(jīng)聚焦后達(dá)到吸收池?，F(xiàn)代高級(jí)分光光度計(jì)往往采用雙單色器，即包含兩個(gè)光柵或兩個(gè)棱鏡，或一個(gè)棱鏡一個(gè)光柵，這樣可以減少雜散光，提高儀器的分辨能力。第9頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（三）吸收池吸收池是用以盛裝樣品溶液進(jìn)行測(cè)定的容器。

可見光區(qū)用玻璃吸收池；紫外區(qū)需用石英吸收池。池厚（內(nèi)徑）有0.5，1，2cm等幾種，一般使用1cm的，吸收池的光潔度對(duì)測(cè)定影響很大，透明光學(xué)面不得用手指拿，不得用毛刷等硬物擦洗，通常用擦鏡紙擦洗。測(cè)定時(shí)如遇揮發(fā)性液體或氣體，需蓋上池蓋，以免溶液揮發(fā)影響測(cè)定濃度或產(chǎn)生氣體損害儀器部件。第10頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（四）檢測(cè)器檢測(cè)器的功能是檢測(cè)光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。檢測(cè)器主要部件為光電池或光電倍增管等。光電倍增管是當(dāng)前應(yīng)用最多的一種檢測(cè)器，它的作用是利用二次電子發(fā)射以放大光電流，放大倍數(shù)可達(dá)108倍。對(duì)檢測(cè)器的要求是靈敏度高、對(duì)輻射響應(yīng)時(shí)間短、對(duì)輻射能量響應(yīng)的線性關(guān)系良好、噪音小、性能穩(wěn)定等。第11頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（五）測(cè)量信號(hào)指示系統(tǒng)用光電倍增管作檢測(cè)器，需要將檢測(cè)器信號(hào)放大以后用記錄器記錄下來，不同型號(hào)分光光度計(jì)記錄裝置不同，目前許多由微處理機(jī)控制的紫外可見分光光度計(jì)，可自動(dòng)調(diào)零，自動(dòng)篩選波長(zhǎng)，自動(dòng)設(shè)置參數(shù)、掃描與計(jì)算均自動(dòng)完成，大大減少了人為誤差。第12頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、分光光度法的基本定律（一）光吸收定律

用分光光度法進(jìn)行定量分析是以朗伯－比爾定律(Lambert－Beer’sLaw)為依據(jù)的，它是描述各種類型的電磁輻射被介質(zhì)吸收規(guī)律的基本定律，簡(jiǎn)稱比爾定律。定律具體內(nèi)容是：當(dāng)一束平行的單色光（I0）射入具有平行平面的吸光介質(zhì)（溶液）時(shí)，一部分（I）透過介質(zhì)（溶液），一部分光被介質(zhì)（溶液）所吸收。光的強(qiáng)度隨介質(zhì)的厚度及吸光物質(zhì)的濃度的遞增而依指數(shù)規(guī)律遞減。第13頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

比爾定律基本公式如下：式中：A——吸光度（absorbence）

T——透光度（transmittance）或稱透射率；

I0——入射光強(qiáng)度；

I——透過強(qiáng)度；

L——光程長(zhǎng)度即樣品溶液的厚度（通常為吸收池的厚度）；

C——樣品溶液的濃度；

K——。此公式一般適合于稀溶液，也可用于氣體或固體。第14頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

在具體應(yīng)用時(shí)，被測(cè)溶液濃度可用mol/L或百分濃度來表示。用mol/L來表示時(shí)，用L為1cm比色池，相應(yīng)的吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)（molarabsorptivity）用符號(hào)ε表示用百分濃度g/100ml來表示時(shí)，L為1cm比色池，相應(yīng)吸光系數(shù)稱為百分吸光系數(shù)，用符號(hào)表示。

E與ε的關(guān)系如下：式中：

m——物質(zhì)的分子量第15頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

測(cè)定ε值得意義

(1)根據(jù)ε值的大小，可以確定化合物吸光度的強(qiáng)弱，ε值＞104為強(qiáng)吸收，ε＝103－104為較強(qiáng)吸收，ε＝102－103為較弱吸收，ε＜102為弱吸收。

(2)ε值大小與電子躍遷種類及電子在兩個(gè)能級(jí)間躍遷的幾率有關(guān)，如不飽和雙鍵化合物，可以產(chǎn)生π→π*躍遷，ε值則很大，屬于強(qiáng)吸收。又如n→σ*及π→π*躍遷，所需能量相差不多，但二者中π→π*躍遷幾率較大，因此ε值比n→σ*的大，約為104，屬?gòu)?qiáng)吸收。

(3)ε值可以衡量不同物質(zhì)在同一波長(zhǎng)下吸收能力的強(qiáng)弱，在同一波長(zhǎng)下，ε值越大吸收光能力愈強(qiáng)。

(4)對(duì)同一化合物而言，在不同波長(zhǎng)下具有不同的ε值，但在一定波長(zhǎng)下，它又是一個(gè)特征常數(shù)，因此可作為有機(jī)化合物定性鑒定的參數(shù)之一。

(5)ε值是衡量分析靈敏度高低的依據(jù)之一，ε值越大，靈敏度越高。第16頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）吸收曲線吸收曲線又稱為光譜曲線或光吸收曲線，是指用固定濃度及吸收池的厚度，在不同波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)得相應(yīng)的吸光度（A），然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，所得的吸光度－波長(zhǎng)曲線，即為吸收曲線。如圖6－2所示。第17頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第18頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

曲線的峰稱為吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)，用λmax表示。曲線的谷所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最小吸收波長(zhǎng)，用λmin表示。峰旁一個(gè)小的曲折稱為肩峰，在吸收曲線的波長(zhǎng)最短一端不成峰形的部分，稱為末端吸收。吸收曲線有時(shí)也可用ε或logε作為縱坐標(biāo)。此外也可用百分透光度為縱坐標(biāo)，但應(yīng)用較少。圖6－3繪出了不同濃度的“稀禾定”溶液的吸收曲線。從圖中看出，同一物質(zhì)即使?jié)舛雀淖?，其吸收曲線形狀及最大吸收波長(zhǎng)不變，三種濃度的最大吸收波長(zhǎng)均為283nm。第19頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第20頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

吸收曲線的用途：（1）吸收曲線的特征和形狀是由分子的電子結(jié)構(gòu)決定的，它反映了物質(zhì)分子中能級(jí)的變化情況；（2）它描述了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收能力，在定量分析中可作為選擇最大吸收波長(zhǎng)的依據(jù)；（3）吸收曲線體現(xiàn)了物質(zhì)的特性，不同物質(zhì)具有不同特征的吸收曲線，因此可用作定性鑒定的依據(jù)。第21頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（三）對(duì)比爾定律的偏離根據(jù)比爾定律的原則，當(dāng)吸收池厚度不變，以吸光度對(duì)濃度作圖時(shí)，應(yīng)得到一條通過原點(diǎn)的直線，但在實(shí)際工作中，吸光度與濃度之間的線性關(guān)系常常發(fā)生偏離，使曲線彎曲，發(fā)生正偏差或負(fù)偏差。如圖6－4所示。第22頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第23頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

偏離比爾定律的因素主要有：

1．被測(cè)溶液濃度過大

比爾定律只適用于測(cè)定稀溶液，在濃度高時(shí)由于產(chǎn)生吸收的組分中粒子密度變大，以致每個(gè)粒子都可以影響鄰近粒子的電荷分布，這種粒子間的相互作用，使吸收輻射的能力發(fā)生了改變，以致發(fā)生偏離。

2．化學(xué)偏離

由于吸收組分的締合、解離、光化學(xué)作用或與溶劑的相互作用，使吸收峰的形狀、位置、強(qiáng)度以及精細(xì)結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化，導(dǎo)致偏離。

3．雜光的影響

比爾定律要求被測(cè)溶液吸收的光是單色光，但事實(shí)上由于分光光度計(jì)的單色器的輸出狹縫分離出的光?；煊信c選定譜帶無關(guān)的雜光，這種多色光，則導(dǎo)致對(duì)比爾定律的偏離。一般良好的可見紫外分光光度計(jì)在全譜域雜光可保持低于0.1％。由表6－2可見，含雜光的比率越高，對(duì)測(cè)定靈敏度的影響就愈大。第24頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第25頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4．譜帶寬度的影響

在實(shí)際測(cè)定樣品時(shí)，為了保證足夠的光強(qiáng)，分光光度計(jì)的狹縫必須保持一定寬度，因此，由出射狹縫投射到被測(cè)物質(zhì)上的光，并不是真正的單色光，而是一個(gè)有限寬度的譜帶，稱為光譜帶通。隨著光譜帶通寬度的增大，光源譜帶增寬，譜帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)逐漸消失，峰值吸光度降低，工作曲線的斜率也隨之降低，從而偏離比爾定律。

5．其它因素的影響

除上述主要因素外，試樣中含有懸浮率或膠粒，以及會(huì)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都會(huì)使透射光強(qiáng)度減少而偏離比爾定律。第26頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(四)精密度與檢出限

1．精密度可見及紫外分光光度計(jì)產(chǎn)生誤差的主要來源，在于吸光度的測(cè)量誤差。根據(jù)比爾定律公式可以改寫為

上式左邊換成自然對(duì)數(shù)，然后兩邊取微分，可得：

上述公式兩式相除，經(jīng)過整理可得下式：

第27頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

如以有限值表示又可以寫成式中：——濃度相對(duì)誤差，

ΔT——透光率T測(cè)量中的絕對(duì)誤差。

通常市售的分光光度計(jì)透光率的測(cè)量誤差一般在±0.002到±0.01之間。假設(shè)透光率測(cè)量誤差ΔT為0.005，通過以上公式計(jì)算，可得到與T及A的函數(shù)關(guān)系數(shù)據(jù)列于表6—3。第28頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三表6－3濃度百分誤差的變差與透過率T、吸光度A的函數(shù)關(guān)系（假定為ΔT±0.005）透過率T吸光度A濃度百分誤差×1000.950.022±10.20.900.046±4.740.800.097±2.800.700.155±2.000.600.222±1.630.500.301±1.440.400.399±1.360.300.523±1.380.200.699±1.550.101.000±2.170.0301.523±4.750.020

1.699

±6.38

第29頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2．檢出限檢出限不僅決定于吸光系數(shù)。也決定于所用儀器的噪聲水平。對(duì)多數(shù)商品分光光度計(jì)而言，1％吸收(T＝0.99，A＝0.004)與其最小可測(cè)信號(hào)相符。在理想情況下，摩爾吸光系數(shù)可高達(dá)105，如使用1cm光程吸收池，吸光度范圍在0.1—1.5時(shí)，濃度范圍則為1×10－6—

1.5×10－5mol／L。如果待測(cè)化合物的摩爾吸光系數(shù)為105，使用10cm吸收池則近似檢出限將是4×10－9mol／L。第30頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、分子結(jié)構(gòu)與電子光譜

（一）可見及紫外吸收光譜的產(chǎn)生物質(zhì)的分子在室溫下，一般處于基態(tài)能級(jí)，當(dāng)它受到電磁輻射的作用時(shí)，吸收一定能量的光子，使分子受到激發(fā)，就從原來能量較低的基態(tài)能級(jí)躍遷到能量較高的能級(jí)(激發(fā)態(tài))，而產(chǎn)生吸收光譜。分子躍遷有三種類型，即電子躍遷，振動(dòng)躍遷及旋轉(zhuǎn)躍遷，這三種躍遷所需的能量不同，可以產(chǎn)生三種不同的吸收光譜，即電子光譜、振動(dòng)光譜及轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。振動(dòng)光譜及轉(zhuǎn)動(dòng)光譜能級(jí)躍遷需要能量較小，位于紅外區(qū)及遠(yuǎn)紅外區(qū)，電子躍遷所需能量最大，在1—20eV(電子伏特)之間，位于可見與紫外光區(qū)，這種光譜又稱為電子光譜或可見紫外光譜。本章要討論的可見紫外光譜就是由電子躍遷所產(chǎn)生的。第31頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1．有機(jī)化合物中價(jià)電子的類型在有機(jī)化合物中有幾種不同性質(zhì)的價(jià)電子，根據(jù)分子中電子成鍵的種類不同，可分為三種類型：形成單鍵的電子稱為σ鍵電子；形成雙鍵的電子稱π鍵電子，氧、氮、硫、鹵素等含有未成鍵的電子稱為孤對(duì)n電子。以醛基為例示意如下：當(dāng)有機(jī)化合物吸收紫外光時(shí)，這些價(jià)電子可以從基態(tài)躍遷到較高的能級(jí)狀態(tài)(受激態(tài))，此時(shí)電子所占的軌道稱為σ*，π*反鍵軌道。第32頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．電子躍遷的類型有機(jī)化合物分子中電子躍遷的方式與鍵的性能有關(guān)。電子躍遷主要有下面幾種類型，即σ→σ*、n→σ*、n→π*及π→π*。各種躍遷所需能量大小為σ→σ*＞n→σ*＞π→π*＞n→π*見圖6—6所示。

通常當(dāng)電子由一個(gè)能級(jí)躍遷到另一個(gè)能級(jí)時(shí)，同時(shí)伴隨有振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷。因此，所得到的吸收光譜不是線狀光譜而是帶狀光譜。第33頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第34頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(二)幾個(gè)常用術(shù)語

1．生色基(又稱發(fā)色基團(tuán))

有機(jī)分子中能夠吸收紫外或可見光而引起電子躍遷的不飽和基團(tuán)叫做生色基

(Chromophores)又稱發(fā)色基團(tuán)(Chromophoricgroup)。生色基主要是指共軛多烯系統(tǒng)，含有未成鍵電子對(duì)的雙鍵結(jié)構(gòu)或基團(tuán)、芳香基團(tuán)及部分含有未成鍵電子對(duì)雜原子的基因。常見生色基的最大吸收峰見表6—4。第35頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第36頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2．助色基(又稱助色團(tuán))

某些含有未成鍵電子對(duì)的原子或基團(tuán)，稱為助色基(Auxochrome)，助色基本身在紫外區(qū)沒有特征吸收帶，但當(dāng)它們與生色基連在一起時(shí)，可以使生色基所產(chǎn)生的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，并使其強(qiáng)度增加。這類基團(tuán)有－OH、－NH2、－SH、－SO3H、－COOH、－Cl、－Br等。

3．紅移、藍(lán)移、增色效應(yīng)、減色效應(yīng)紅移(Bathchromic)：指因結(jié)構(gòu)變化(如順反異構(gòu))、共軛體系加大、助色基效應(yīng)、溶液pH變化等引起吸收峰向長(zhǎng)波移動(dòng)的效應(yīng)。藍(lán)移(Hypsochromic)：指由于取代基或溶劑等的影響，使吸收峰向短波方向移動(dòng)的效應(yīng)。增色效應(yīng)(Hyperchromiceffect)：由于結(jié)構(gòu)變化或其它原因使吸收強(qiáng)度增加的現(xiàn)象。減色效應(yīng)(Hypochromlceffect)：使吸收強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。第37頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(三)有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)與電子躍遷及吸收譜帶的關(guān)系

1．飽和單鍵碳?xì)浠衔镏缓益I電子，電子結(jié)合的很牢固，只有吸收很大能量后才能產(chǎn)生σ→σ*躍遷。在近紫外區(qū)沒有吸收峰，只有在遠(yuǎn)紫外區(qū)(10一200nm)才有吸收峰。這已超出了紫外可見分光光度計(jì)的范圍，應(yīng)用不多。

2．飽和烴中氫被氧、氮、硫、鹵素等原子所取代由于這類原子中有孤對(duì)n電子(如－HH2、－OH、－S、－X等)n電子較σ電子容易激發(fā)，可產(chǎn)生n→σ*躍遷，此種躍遷所需能量較σ→σ*小。含這些原子的化合物在150－250nm的紫外區(qū)有吸收峰、少部分在近紫外區(qū)(＜200nm)有吸收。表6—5列出了能進(jìn)行n→σ*躍遷的一些基團(tuán)和原子。第38頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第39頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3．不飽和碳?xì)浠衔?/p>

含有π鍵電子，它比n電子更易于激發(fā)可以產(chǎn)生π→π*躍遷，此種躍遷的能量較σ→σ*及n→σ*都小。吸收峰大都位于紫外區(qū)(200nm)。

具有共軛雙鍵的化合物，由于相間的π與π鍵相互作用。形成大π鍵，使電子更容易激發(fā)，可使吸收峰波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。共軛分子的吸收光譜通常有兩條譜帶，一種稱為K帶(德文“共軛作用”得名)，是由π→π*躍遷所產(chǎn)生。這種躍遷是整個(gè)共軛鍵的基態(tài)向激發(fā)態(tài)的躍遷。例如C＝C—C＝C→C＋—C＝C—C＋；另一種稱為R帶(德文“基團(tuán)”得名)為n→π*躍遷所產(chǎn)生。為共軛體系一端的單個(gè)生色基的躍遷。如－C＝O、－NO2、－N＝N－、－N＝O等。

第40頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第41頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

4．芳香族化合物主要包括苯及芳香雜環(huán)的衍生物：

(1)苯：苯為環(huán)狀共軛體系。其紫外光譜特征是具有π→π*躍遷所引起的三組譜帶。在180－184nm處(ε＝47000)、有強(qiáng)吸收的E1帶，因在遠(yuǎn)紫外區(qū)，實(shí)用意義不大。在204nm處(ε＝7900)有中強(qiáng)吸收的E2帶，E2帶在末端范圍，也不常用。在230－270nm處(ε＝200)有弱吸收的B帶。B帶是由π→π*躍遷及振動(dòng)效應(yīng)的重疊引起的一系列銳峰，又稱“精細(xì)結(jié)構(gòu)”吸收峰。在氣體或非極性溶劑中精細(xì)結(jié)構(gòu)較清楚，在極性溶劑中，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。圖6—7、圖6—8分別為苯的紫外光譜及苯酚的B吸收帶。第42頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第43頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(2)苯的單取代物：在苯環(huán)上有取代基時(shí)，復(fù)雜的B吸收帶一般都簡(jiǎn)單化，向長(zhǎng)波移動(dòng)，同時(shí)吸收強(qiáng)度增加。烷基取代：由于超共軛作用(hyperconjugation)產(chǎn)生紅移，但效應(yīng)不大。帶弧對(duì)電子基團(tuán)取代：如－NH2、－OH、－OK等由于弧對(duì)電子與苯環(huán)上的π電子產(chǎn)生n—π共軛使吸收強(qiáng)度增加．產(chǎn)生紅移。與苯環(huán)共軛的不飽和基團(tuán)取代：如－CH＝CH－、－C＝O、－NO2等。由于π—π共軛，產(chǎn)生新的電子軌道，使波長(zhǎng)顯著紅移?？傊?、取代苯對(duì)光譜紅移影響的大小與取代甚的拉電子和推電子的程度有關(guān)。表6—7列出一些單取代苯的紫外吸收數(shù)據(jù)第44頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第45頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(3)苯的二取代物：在二取代苯中，由于取代基的性質(zhì)和取代位置不同，產(chǎn)生的影響也不同。①當(dāng)一個(gè)吸電基(如－NO2、－C＝O)及一個(gè)供電基(如－OH、－OCH3、－X)互為對(duì)位時(shí)，由于兩代基的效應(yīng)相反，產(chǎn)生協(xié)同作用，使波長(zhǎng)顯著紅移。若兩個(gè)效應(yīng)相反的取代基互為間位或鄰位時(shí)，則二取代苯與各單取代苯的波長(zhǎng)區(qū)別很小。例如為280nm，為

380nm，為280nm。第46頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

②當(dāng)兩個(gè)取代基都是吸電基或都是供電基時(shí)，由于效應(yīng)相同，兩個(gè)基團(tuán)不能協(xié)同，則吸收峰往往不超過單取代基時(shí)的波長(zhǎng)，且鄰、間、對(duì)位三個(gè)異構(gòu)體的波長(zhǎng)也相近。例如為260nm，為258nm，為255nm，為255nm。

第47頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(4)稠環(huán)芳香族化合物：

此類化合物由于共軌體系增加，使波長(zhǎng)紅移，吸收強(qiáng)度增加。例如萘有三個(gè)吸收譜帶，E1譜帶為220nm，ε＝100000，E2譜帶為275nm，ε＝5700，B吸收帶為312nm，ε＝250。菲的譜帶E1為252nm，ε＝50000，E2＝293nm，ε＝16000，B譜帶為330nm，ε＝250。表6—9列出了一些稠環(huán)芳烴的吸收譜帶。第48頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第49頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(5)雜芳環(huán)化合物①五元雜芳環(huán)化合物：如吡咯、呋喃、噻吩，可看作是環(huán)戊二烯的C1被雜原子取代。因此，紫外光譜與環(huán)戊二烯相似。一般有兩個(gè)吸收峰，在200nm附近有一個(gè)峰，屬K帶，在238nm附近還有一個(gè)峰，類似苯環(huán)的B帶。例如：

200nm，238.5nm200nm，252nm211nm，240nm231nm，269.5nm

②六元雜芳環(huán)化合物：六元雜芳環(huán)化合物的紫外光譜與苯相類似，例吡啶在257nm有吸收峰與苯的B帶相似，也有精細(xì)結(jié)構(gòu)，而其n→π*躍遷引起的弱峰多被B帶覆蓋。極性溶劑可使吡啶的B帶吸收強(qiáng)度明顯增高，這可能是吡啶氮原子上的弧對(duì)電子與極性溶劑形成氫鍵的原故。第50頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

5．吸收譜帶躍遷類型相同的吸收峰稱為吸收譜帶又稱吸收帶?；衔锝Y(jié)構(gòu)不同，躍遷類型不同、因而有不同的吸收帶。在前面化合物結(jié)構(gòu)與電子躍遷的關(guān)系中已提到各種吸收帶?，F(xiàn)將吸收帶的種類與特點(diǎn)扼要總結(jié)如下：

(1)R吸收帶：由n→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，它具有雜原子和雙鍵的共軛基團(tuán)。如，，－NO2，－N＝C－等。該帶的特點(diǎn)是吸收強(qiáng)度很弱，處于長(zhǎng)波方向，吸收峰波長(zhǎng)一般在270nm以上。

(2)K吸收帶：由共軛的π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，其特點(diǎn)是吸收峰很強(qiáng)ε＞104。共軛雙鍵增加，波長(zhǎng)紅移，而且吸收強(qiáng)度增加。K帶是共軛分子的特征吸收帶，借此可判斷化合物中共軛結(jié)構(gòu)。第51頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(3)B吸收帶：這是芳香族化合物的特征吸收帶，由苯的π→π*躍遷所產(chǎn)生。為一寬峰并出現(xiàn)精細(xì)結(jié)構(gòu)。吸收峰在230一270nm之間，B帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)常用來識(shí)別芳香族化合物，但當(dāng)苯環(huán)取代后或用極性溶劑時(shí)，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。

(4)E吸收帶；E帶可分為El、E2兩個(gè)吸收帶。二者可分別看成是苯環(huán)中的乙烯鍵和共軛乙烯鍵所引起的，也屬π→π*躍遷。E1帶吸收峰在l84nm左右，在遠(yuǎn)紫外區(qū)不常用。E2帶在203nm處有吸收，E2帶有些書籍也稱它為K帶。E2帶可因苯環(huán)上引入助色基而向紅移。當(dāng)苯環(huán)上引入生色基時(shí)，吸收峰顯著紅移，此時(shí)E2帶就稱為K帶。第52頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五、定量分析（一）試樣的制備

1．溶劑的選擇可見紫外分光光度測(cè)定，通常都是在溶液中進(jìn)行，因此選擇合適的溶劑十分重要。選擇溶劑應(yīng)考慮的原則是：對(duì)試樣有良好的溶解能力和選擇性；在測(cè)定波段內(nèi)溶劑本身無明顯吸收；溶劑不得與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；被測(cè)組分在溶劑中具有良好的吸收峰形。對(duì)于紫外光譜分析，選擇溶劑更為重要，因?yàn)闃O性溶劑對(duì)電子躍遷產(chǎn)生的譜帶有影響。因此在紫外測(cè)定時(shí)，在溶解度允許的范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇極性小的溶劑。分光光度法常用的有機(jī)溶劑見表6—10。第53頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第54頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．樣品的凈化樣品中含有雜質(zhì)，會(huì)直接影響分光光度法的測(cè)定結(jié)果，因此，測(cè)定前必須進(jìn)行凈化。農(nóng)藥原藥和制劑中都含有許多雜質(zhì)，測(cè)定前都必須進(jìn)行凈化處理，常用的方法有薄層層析、液液分配、柱凈化等。也可以用水解、氧化還原或調(diào)節(jié)酸堿性方法等，消除干擾。第55頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(二)測(cè)量條件的選擇

1．波長(zhǎng)的選擇應(yīng)選擇被測(cè)組分最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)作為測(cè)量波長(zhǎng)。因?yàn)樵讦薽ax處，待測(cè)組分每單位濃度的吸光度值變化最大，測(cè)量靈敏度較高，而且吸收曲線在最大波長(zhǎng)附近較為平坦，可以較好的遵守比爾定律。

有時(shí)為避開雜質(zhì)的干擾，而選擇靈敏度稍低的不受干擾的次強(qiáng)吸收峰或肩峰等進(jìn)行測(cè)量。

2．狹縫寬度的選擇狹縫寬度直接影響測(cè)定靈敏度和校正曲線的線性范圍。狹縫寬度增大，在一定范圍內(nèi)可使靈敏度下降，校正曲線線性變壞，偏離比爾定律。狹縫也不是越小越好，狹縫太小，入射光強(qiáng)度變?nèi)酰膊焕跍y(cè)定。一般應(yīng)選擇不減少吸光度時(shí)的最大狹縫寬度為測(cè)量寬度。第56頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3．吸光度與濃度之間關(guān)系的確定在確定了分析條件之后，必須用一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)推曲線的濃度范圍應(yīng)接近實(shí)際試樣的濃度，并在此濃度上下一定范圍包括待測(cè)樣品的濃度范圍，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，可以了解遵循比爾定律的濃度范圍。

4．空白溶液的選擇空白溶液亦稱為參比溶液，在分光光度法測(cè)定樣品時(shí)都需要有空白溶液作為參比。在儀器上將空白溶液的透光率調(diào)成100％，以作為測(cè)量時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)?？瞻兹芤撼司哂袇⒈茸饔猛?，在分光光度測(cè)定中，還可以用來抵消某些雜質(zhì)的干擾．例如所用試劑或溶劑不純、顯色劑本身有顏色、以及無法去除的雜質(zhì)色澤等，都會(huì)影響吸光度的測(cè)定，此時(shí)可用相應(yīng)的空白溶液消除其影響。第57頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(三)反應(yīng)條件

1．顯色劑的選擇

在可見光區(qū)進(jìn)行分光光度測(cè)定時(shí)，常需選擇合適的顯色劑將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锘蚪j(luò)合物，然后進(jìn)行測(cè)定。選擇顯色劑的原則是：顯色反應(yīng)靈敏度高，—般應(yīng)在100ppm以內(nèi)；顯色劑選擇性好，對(duì)雜質(zhì)無反應(yīng)或反應(yīng)?。伙@色穩(wěn)定性好，生成的有色化合物顏色要穩(wěn)定，組成要恒定；符合比爾定律；受溶液的酸度、溫度等因子影響要小等。

第58頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2．顯色條件的選擇

顯色條件包括試劑的濃度、溶液的酸度、顯色時(shí)間、反應(yīng)溫度、雜質(zhì)的干擾等。

(1)試劑的濃度：顯色過程中加入的試劑或顯色劑的量，會(huì)影響有色化合物的組成，常使顏色發(fā)生變化，因此試劑(顯色劑)的加入量必須通過實(shí)驗(yàn)確定，應(yīng)做一條吸光度與試劑(顯色劑)濃度的變化曲線，在吸光度值恒定的范圍內(nèi)確定試劑(顯色劑)的濃度。

(2)溶液的酸度：顯色過程都是在一定的酸度條件下進(jìn)行的，酸度高低對(duì)絡(luò)合物的形成，顏色的穩(wěn)定性，水解、沉淀等都有很大影響。顯色反應(yīng)的最佳酸度范圍可以通過實(shí)驗(yàn)確定，即做一條吸光度與溶液pH值的變化曲線，在吸光度值恒定部分對(duì)應(yīng)的pH值，即為最佳酸度范圍。第59頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(3)顯色時(shí)間：

顯色過程中由于顯色反應(yīng)不同，需要的時(shí)間也不同，有時(shí)顏色不穩(wěn)定，放置時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)變色或退色，影響測(cè)定結(jié)果。因此，顯色反應(yīng)后，必須在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)測(cè)定吸光度，通過實(shí)驗(yàn)確定合適的顯色時(shí)間。

(4)反應(yīng)溫度：

顯色反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行，但個(gè)別反應(yīng)需要在特定的溫度下進(jìn)行，因此，需要根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)選擇合適的反應(yīng)溫度。

(5)雜質(zhì)的干擾：

試樣中的雜質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)會(huì)造成很大干擾，必須去除雜質(zhì)干擾的影響。去除雜質(zhì)的方法有：加入掩蔽劑，選擇合適的顯色條件；選擇不受干擾的測(cè)定波長(zhǎng)，利用空白溶液的抵消或通過薄板、柱層析、離子交換等方法，使被測(cè)組分與干擾雜質(zhì)分離。第60頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三六、在農(nóng)藥分析中的應(yīng)用(一)農(nóng)藥分析的特點(diǎn)

1．測(cè)量范圍廣

大多數(shù)農(nóng)藥為芳香族化合物，化合物本身或其衍生物在可見紫外區(qū)都有吸收峰。在農(nóng)藥分析上，配合薄層法凈化，可用于測(cè)定原藥及制劑中有效成分含量，也可劇定農(nóng)藥殘留量及痕量農(nóng)藥，其靈敏度和準(zhǔn)確度可與近代儀器相比美。

2．操作簡(jiǎn)便快速

可見紫外分光光度計(jì)，儀器成本較低，易于掌握．隨著近代分光光度計(jì)的產(chǎn)生，在測(cè)量計(jì)算方面通過微機(jī)控制，使測(cè)定結(jié)果既快速又準(zhǔn)確，

3．有較好的準(zhǔn)確度

一般的濃度測(cè)量，相對(duì)誤差在1％－3％范圍內(nèi)。如用示差分光光度法，誤差可以減少到千分之幾。

4．既可定量也可用于定性

除可用于大多數(shù)農(nóng)藥的定量分析外，還可以作為定性手段，并常和紅外光譜、核磁共振相配合，作為定性鑒定的工具。第61頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(二)可見比色分析可見比色分析法就是吸收光譜在可見光范圍內(nèi)的分光光度法?？梢姽獠ㄩL(zhǎng)范圍是由紫色的400nm到紅色的760nm。隨著分光光度計(jì)的發(fā)展，比色測(cè)定已由分光光度計(jì)代替了舊時(shí)的比色計(jì)。分光光度計(jì)與比色計(jì)相比，具有準(zhǔn)確、省時(shí)、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)代的分光光度計(jì)都具有掃描功能，可以通過吸收曲線，找出被測(cè)物質(zhì)的最佳吸收波段，還可以從吸收曲線上選擇合適的條件，以減少雜質(zhì)的干擾。第62頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

農(nóng)藥的可見光比色分析有以下幾種情況：

農(nóng)藥有效成分本身帶有顏色，可以直接進(jìn)行比色，這種農(nóng)藥數(shù)量很少，如敵克松原藥為黃棕色，在波長(zhǎng)435nm處有最大吸收峰。故可直接進(jìn)行比色測(cè)定。

農(nóng)藥本身無色，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)，引入或生成一個(gè)顯色基團(tuán)而變成有顏色的化合物，此過程稱為“顯色”，大多數(shù)農(nóng)藥都需要顯色，才能進(jìn)行測(cè)定。

(1)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)可以生成有色化合物，如對(duì)硫磷經(jīng)堿解后形成對(duì)硝基酚而呈黃色。五氯酚經(jīng)氧化形成四氯代苯醌呈黃色。

(2)引入顯色基團(tuán)生成有色化合物：如農(nóng)藥經(jīng)酸、堿水解產(chǎn)生酚類或芳胺，可與偶氮試劑進(jìn)行偶合形成有色化合物，偶氮試劑則稱為顯色劑。第63頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1．含氯農(nóng)藥的顏色反應(yīng)

(1)吡啶—堿顯色反應(yīng)(Fujiwara反應(yīng))

含鹵素農(nóng)藥在堿性溶液中，與吡啶短時(shí)間加熱，至少有兩個(gè)鹵原子和一個(gè)碳原子成鍵，產(chǎn)生紅色或藍(lán)色。如DDT與含有呫啐酚的吡啶溶液及氫氧化鉀加熱生成紅色。可在510nm處測(cè)定光密度。三氯殺螨醇在堿性條件下，水解產(chǎn)生氯仿，氯仿在堿—吡啶作用下生成紅色，可在535nm處測(cè)光密度。氯丹可以產(chǎn)生紫色(404nm)，毒殺芬可產(chǎn)生黃色(400nm)，七氯、克菌丹、敵敵畏等都有此反應(yīng)，反應(yīng)過程中，含有水或乙醇對(duì)顏色形成有干擾。

第64頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(2)硝化—甲醇鈉法；含氯芳香族農(nóng)藥，經(jīng)硝化后加甲醇鈉，形成四硝基衍生物，經(jīng)分子重排變?yōu)轷剑仕{(lán)色。如對(duì)位DDT、對(duì)位DDD及三氯殺螨醇形成藍(lán)色(598nm)；DDE，DDA形成紅色（420nm），鄰位DDT形成紫色(590－511nm)。第65頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

六六六需加堿水解成l，2，4三氯代苯再經(jīng)硝化與甲醇鈉反應(yīng)形成6氯2，4二硝基間苯二酚，呈黃色，可在415nm處測(cè)定光密度。第66頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(3)脫氯磺化顯色反應(yīng)：

DDT，甲氧DDT等在1％乙醇?xì)溲趸涢F液中，脫掉一分子氯化氫，再與濃硫酸反應(yīng)，即呈現(xiàn)顏色，DDT為桃紅色；甲氧DDT為紫色。

(4)二苯胺—氯化鋅顯色反應(yīng)：狄氏劑、毒殺芬等經(jīng)與二苯胺、氯化鋅混合熔融，而形成藍(lán)綠色化合物，將此化合物用丙酮或冰醋酸溶解，即可進(jìn)行比色。

(5)濃硫酸與鉻變酸顯色反應(yīng)；鹵代苯氧乙酸類與濃硫酸反應(yīng)產(chǎn)生甲醛，再與鉻變酸(1，8二羥萘、3，6二磺酸)加熱到150℃出現(xiàn)紫色。第67頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2．含磷農(nóng)藥的顏色反應(yīng)

(1)鉬藍(lán)比色法測(cè)全磷：含磷農(nóng)藥用高氯酸及硫酸混合液，消化分解成無機(jī)磷，在酸性條件下與鉬酸銨及偏釩酸銨反應(yīng)形成磷鉬雜多酸，顯黃色，在420nm處測(cè)定光密度。

PO33－＋12MoO42－＋3NH4＋＋24H＋

→[(NH4)3·PO4·12MoO3]＋12H2O

如在鉬酸銨中加入1氨基—2萘酚—4磺酸試劑或SnCl2則顯藍(lán)色，在735nm處測(cè)定光密度，所有有機(jī)磷農(nóng)藥均可用此法測(cè)定全磷含量。第68頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(2)4－(對(duì)硝基芐基)吡啶(NBP)反應(yīng)：有機(jī)磷農(nóng)藥在乙醇中與4—(