動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)生物反應(yīng)工程課件共講

動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)生物反應(yīng)工程課件共講第1頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.1動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是一項(xiàng)將動(dòng)植物組織、器官或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)菌繁殖的技術(shù)。5.1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無(wú)法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價(jià)值的生物制品，需要借助于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。第2頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

早在1907年，美國(guó)的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。

1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)病毒的報(bào)告，開(kāi)拓了以動(dòng)物病毒為研究對(duì)象的新領(lǐng)域。作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK）的懸浮培養(yǎng)。隨后，采用在培養(yǎng)液中添加人工合成的小球狀惰性聚合體載體，大幅度提高了細(xì)胞的產(chǎn)量，并在10000升發(fā)酵罐內(nèi)成功地進(jìn)行深層培養(yǎng)。第3頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性。使得動(dòng)物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生成多種生物制品，例如病毒疫苗、淋巴因子（干抗素和白細(xì)胞介素等）、單克隆體、紅細(xì)胞生成素、纖維蛋白溶酶原激活劑、第八因子、腫瘤壞死因子、上皮生長(zhǎng)因子和過(guò)氧化物歧化酶等。這些采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。第4頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素；大多數(shù)哺乳動(dòng)物需附著在固體或半固體的表面生長(zhǎng)；對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格；大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡(jiǎn)單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點(diǎn)第5頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)性能的相比項(xiàng)目哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞大小[μm]懸浮生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求倍增時(shí)間[h]細(xì)胞分化環(huán)境的敏感性細(xì)胞壁產(chǎn)物存在產(chǎn)物濃度（%）含水量產(chǎn)物種類10～100可以，多采用貼壁很復(fù)雜15～100有非常敏感無(wú)1～25胞內(nèi)或胞外低～疫苗、激素、抗體、生長(zhǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)劑等10～100可以，但細(xì)胞易聚集復(fù)雜15～100有限分化敏感有20～30胞內(nèi)低～90酶、生物堿、天然色素、有機(jī)化合物等1～10可以簡(jiǎn)單0.5～5無(wú)一般有100～1000胞內(nèi)或胞外高～75發(fā)酵食品、抗生素、有機(jī)化合物、酶等第6頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要危險(xiǎn)之一是微生物污染。設(shè)備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復(fù)雜性都易引起微生物污染，這是細(xì)胞培養(yǎng)都存在的一個(gè)普遍問(wèn)題，在大規(guī)模培養(yǎng)更為嚴(yán)重。動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體（mycoplasma）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易檢出。因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個(gè)設(shè)備精良的細(xì)胞庫(kù)（cell

bank）。在細(xì)胞庫(kù)中的冷凍細(xì)胞不受污染。第7頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清和蛋白胨。原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問(wèn)題。因?yàn)檠鍋?lái)源困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來(lái)困難等。雖然可采用無(wú)血清培養(yǎng)基，但在無(wú)血清培養(yǎng)基中更可能出現(xiàn)細(xì)胞毒。因此，與培養(yǎng)物相接觸的水必須采用高純度的水。培養(yǎng)基一般需經(jīng)膜過(guò)濾器過(guò)濾。可保證其無(wú)菌狀態(tài)，但支原體也可被0.1μm的過(guò)濾膜濾出。第8頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

目前，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)的有用產(chǎn)品大致可分為4大類：（1）疫苗如狂犬病疫苗、麻疹疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗等。（2）干抗素如α-干擾素和β-干擾素等。（3）單克隆抗體如抗綿羊紅細(xì)胞單克隆抗體等。（4）遺傳重組產(chǎn)品如人生長(zhǎng)激素、免疫球蛋白等。第9頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）生長(zhǎng)速率慢，易為微生物等污染，但可采用在培養(yǎng)基中加入抗生素等措施；（2）細(xì)胞個(gè)體大且無(wú)壁，對(duì)環(huán)境敏感，因此應(yīng)慎重解決供氧（攪拌與通風(fēng)）與細(xì)胞脆弱的矛盾；（3）設(shè)備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應(yīng)過(guò)程的經(jīng)驗(yàn)；（4）反應(yīng)過(guò)程成本高，主要用于高附加值產(chǎn)物的生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的特征第10頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性1902年，德國(guó)植物學(xué)家G.Haberlandt就預(yù)言植物細(xì)胞培養(yǎng)的可能性。

1937年前后，法國(guó)和美國(guó)科學(xué)家分別成功的進(jìn)行了胡蘿卜和煙草的組織培養(yǎng)。

1966年Klein指出，能利用植物細(xì)胞培養(yǎng)物代替收集或栽培植株來(lái)生產(chǎn)生化制品。近40年來(lái)，植物細(xì)胞培養(yǎng)研究成功的例子已有不少，如用紫草懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧；煙草細(xì)胞的大量培養(yǎng)等等。第11頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

與微生物相比，植物細(xì)胞具有的特性細(xì)胞大，細(xì)胞壁以纖維素為主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低；與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類同，生長(zhǎng)速率慢，為防止培養(yǎng)過(guò)程中染菌，需加抗生素；細(xì)胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液粘度大，且不能強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低；細(xì)胞常生長(zhǎng)成各種大小的團(tuán)塊，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。第12頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三20世紀(jì)90年代以來(lái)，伴隨著紫杉醇的研究成功并應(yīng)用于臨床，植物細(xì)胞培養(yǎng)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入了新的發(fā)展時(shí)期，尤其是誘導(dǎo)子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀亙和冠癭瘤組織培養(yǎng)等新技術(shù)和新方法的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，更顯示了植物細(xì)胞培養(yǎng)工程制藥的廣闊發(fā)展前景。另外，將固定化技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究對(duì)有效的改善植物細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的不足有一定成效?？梢哉J(rèn)為，固定化技術(shù)是有可能在植物細(xì)胞培養(yǎng)中得以應(yīng)用。第13頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.2植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)5.2.1動(dòng)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)模型一、碳源與生長(zhǎng)模型微生物反應(yīng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與限制性基質(zhì)間的關(guān)系常用Monod方程來(lái)描述。同理，Monod方程也可以用于表達(dá)某些碳源與動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)速率間的關(guān)系。例如，在植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，多以蔗糖為碳源，安田曾報(bào)道，煙草細(xì)胞在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與蔗糖濃度的關(guān)系可利用Monod方程來(lái)表達(dá)，此時(shí)。第14頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

蔗糖為碳源時(shí)，植物細(xì)胞首先分解蔗糖為葡萄糖和果糖，而后優(yōu)先利用葡萄糖。分別以果糖或葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí),前者有：后者為：第15頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

由于動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程是好氧過(guò)程，因此，許多科技工作者研究了與細(xì)胞呼吸速率相關(guān)的因素。例如，人參細(xì)胞培養(yǎng)中，添加椰子汁后細(xì)胞的生長(zhǎng)速率加快，耗氧量較不添加椰子汁時(shí)明顯增大。另外，也有報(bào)道，Acer．PsedoplatanusＬ細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞體內(nèi)的含氮量與耗氧量有正比例關(guān)系。二、呼吸與生長(zhǎng)模型第16頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

加藤等所獲得的煙草細(xì)胞分批培養(yǎng)的結(jié)果表明：當(dāng)氧為細(xì)胞生長(zhǎng)的限制性因素時(shí)，與Qo2有與上式相似的關(guān)系。說(shuō)明植物細(xì)胞培養(yǎng)中氧的消耗，部分用于維持代謝，部分用于生長(zhǎng)繁殖，所獲得的

一般好氧微生物的比生長(zhǎng)速率μ與菌體的維持常數(shù)m及氧的比消耗速率Qo2有如下關(guān)系：這可能是植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的重要特性。與一般微生物的m和Y值相比，m很小而Y較大。第17頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、胞內(nèi)物質(zhì)與生長(zhǎng)模型

微生物培養(yǎng)中，把細(xì)胞內(nèi)RNA含量作為描述其生長(zhǎng)速率的指標(biāo)。且隨微生物比生長(zhǎng)速率的增加，RNA含量增大。在植物細(xì)胞的培養(yǎng)中也有類似的報(bào)道。吉田等在進(jìn)行人參細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞的RNA含量顯著增大。培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí)，人們?cè)敿?xì)研究了細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率與細(xì)胞內(nèi)RNA的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與一般微生物相似，可以用一次方程表達(dá)。即：

綜上所述，動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究，在很大程度上是借鑒于微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論。第18頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.2.2植物細(xì)胞的培養(yǎng)一、植物細(xì)胞的培養(yǎng)操作培養(yǎng)方式：根據(jù)所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)與固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)法，根據(jù)操作方式的不同，又分為分批式、反復(fù)分批式和連續(xù)式培養(yǎng)3種。第19頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

植物細(xì)胞的分批培養(yǎng)與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡(jiǎn)單，從實(shí)驗(yàn)室到大型罐廣泛應(yīng)用。分批培養(yǎng)中，植物細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線一般呈S型，可明顯觀察出誘導(dǎo)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期。但是與細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)相比，即使是生長(zhǎng)速率快的煙草細(xì)胞，分批培養(yǎng)時(shí)間（一個(gè)周期）也要6天以上，生長(zhǎng)緩慢。1、分批培養(yǎng)第20頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

生物種類μ(h-1)平均時(shí)代時(shí)間(h)

煙草0.032～0.0421.7～17.3

番茄0.014～0.02649.5～26.7

人參0.02133.0

釀酒酵母0.5～0.651.39～1.07

紅曲霉0.1255.54植物與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)速率的比較第21頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

目前，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是在工廠中，大至20噸罐，廣泛采用分批式操作。藤田開(kāi)發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時(shí)使用兩個(gè)反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器主要是為大量培養(yǎng)細(xì)胞，第二個(gè)反應(yīng)器是為增加目的產(chǎn)物的含量。分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但濃度過(guò)高又會(huì)造成接種細(xì)胞的死亡。第22頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

若反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積為V，補(bǔ)加量為F′（等于取出量），則比值F′/V稱為替換率D′。D′與連續(xù)培養(yǎng)中的稀釋率D不同，其與培養(yǎng)液取出至加入完成期間的比生長(zhǎng)速率μ′有如下關(guān)系：

在上式中，Xt和X0分別為時(shí)間t=t和t=0時(shí)的細(xì)胞濃度。硅地的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反復(fù)分批培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率D'X要大于分批培養(yǎng)時(shí)的生產(chǎn)速率。2、反復(fù)式分批培養(yǎng)第23頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

植物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)與微生物的連續(xù)培養(yǎng)相同，對(duì)于一單罐連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的物料衡算式為：V——培養(yǎng)液體積X——細(xì)胞濃度

t——時(shí)間F——培養(yǎng)液的流加速率3、連續(xù)培養(yǎng)第24頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三根據(jù)比生長(zhǎng)速率和稀釋率的定義，上式變形為：(5-7)

穩(wěn)定狀態(tài)下，μ=D，細(xì)胞生長(zhǎng)速率為XD。畦地等人使用20噸罐，連續(xù)66天培養(yǎng)煙草細(xì)胞BY-2，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率XD=5.82g/(L·d)。一般連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)率高于分批培養(yǎng)的，但由于植物細(xì)胞生長(zhǎng)速率慢，維持長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)菌狀態(tài)是需要解決的基本技術(shù)問(wèn)題。另外，單罐連續(xù)培養(yǎng)法并不能適應(yīng)各種反應(yīng)，因此，有必要開(kāi)發(fā)一些新的方法。第25頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)5.3.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法

培養(yǎng)方法有兩種類型：非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)：來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于這一類型，其可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞屬于這一類型，它們需要附著于適量正電荷的固體或半固體的表面上生長(zhǎng)。第26頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是一類能無(wú)限繁殖的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞又稱為確立細(xì)胞株。由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力的敏感，豐富培養(yǎng)基容易形成過(guò)多泡沫，這都增加了反應(yīng)器操作的難度。懸浮培養(yǎng)多采用分批式操作方法，其原理與植物細(xì)胞的類同。第27頁(yè)，共31頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

另外，適用于動(dòng)物細(xì)胞的還有一種連續(xù)式操作方法——灌流培養(yǎng)法。這種方法是把細(xì)胞置于某種封閉系統(tǒng)中，連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，連續(xù)等量排出用過(guò)的培養(yǎng)基，但不排出懸浮的細(xì)胞。采用這種方法后，從產(chǎn)物開(kāi)始分泌時(shí)起，便可用快速純化方法不斷的從流出培養(yǎng)基中收集目的產(chǎn)物。雖然灌流培養(yǎng)系統(tǒng)具有如上優(yōu)點(diǎn)，但也存在培養(yǎng)基消耗量比