實驗一質粒DNA的小量制備課件

質粒DNA的小量制備基礎植物生物技術提綱目的1原理2材料3方法4注意事項5一、目的掌握一種較常用的提取質粒DNA的方法三、材料(一)儀器

超凈工作臺；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；搖床；2102型分光光度計；Eppendorf5417C常溫高速離心機；XW-80型旋渦混合器；電熱恒溫水浴鍋；低溫冰箱(-20℃)～-70℃)；穩(wěn)壓電泳儀(0～500V，0～300mA)；Chemi-Smart2000/3000型化學發(fā)光及凝膠成像系統(tǒng)；(二)器皿

刻度搖菌管，微量移液器，標記筆,EP管(三)菌種

大腸桿菌DH-5α中的Hm質粒(四)培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10克﹑酵母提取物5克和氯化鈉10克用蒸餾水溶解至1000毫升，用10mMNaOH調至pH7.2-7.4,濕熱滅菌20分鐘。

三、材料(五)試劑

1．溶液I[50mM葡萄糖10mMEDTA25mMTris-HCI(pH8.0)]配制方法

：吸取母液1M葡萄糖2.5毫升;0.5MEDTA1毫升;1MTris-HCI

(pH8.0)12.5毫升,加無菌水至50毫升2．溶液Ⅱ[0.2MNaOH；1％SDS]配制方法：1M

NaOH

2毫升﹑10％

SDS1毫升加無菌水至10毫升3．溶液Ⅲ[KAC(pH4.8)緩沖溶液]配制方法：5MKAC

60毫升﹑冰醋酸

11.5毫升加無菌水至100毫升三、材料(五)試劑7.Tris飽和酚8.氯仿-異戊醇(24:1)：取240毫升氯仿，加入10毫升異戊醇,充分混勻9.預冷無水乙醇：無水乙醇保存在-20℃冰箱中備用。10.TAE電泳緩沖液：40mMTris-HCI(pH8.0)、20mMNaAC、2mMEDTA。三、材料(五)試劑11.溴酚藍指示劑溶液：0.2％溴酚藍、40％蔗糖配制方法：0.2克溴酚藍、40克蔗糖用100毫升無菌水充分溶解，4℃保存。12.0.8%瓊脂糖制備配制方法：用100毫升TAE電泳緩沖液加上0.8克瓊脂糖加熱完全溶解后，加入6微升10毫克/毫升EB于45℃倒入插有點樣梳的制膠槽。三、材料四、方法1．取平板活化后的菌落接種于含50毫克／升Kan的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

平板活化震蕩培養(yǎng)

接種于LB培養(yǎng)基加50毫克/升Kan四、方法3．取沉淀，重懸于100微升溶液I，于XW-80型旋渦混合器上完全分散，室溫放置5分鐘；

4．加人新配的溶液Ⅱ200微升，蓋緊管口,立即反復倒置5次，室溫放置5分鐘；5．加入溶液Ⅲ150微升，倒置混勻，于冰上放置10分鐘；加溶液I加溶液Ⅱ

加溶液Ⅲ

6．12000rpm離心10分鐘，取上清，計算體積；7．加入等體積的酚和氯仿-異戊醇(24:1)，混合后于12000rpm離心10分鐘，取上清，加入1.5毫升EP管，計算體積；8．加人2倍體積預冷無水乙醇沉淀核酸，室溫放置10分鐘；四、方法加氯仿-異戊醇加無水乙醇9．12000rpm離心10分鐘、小心除去上清，將離心管倒置于紙巾上；10．加7