真菌感染實驗診斷課件

第三章真菌感染實驗診斷第一節(jié)真菌的基本特性

真菌是一大類具有典型細胞核，不含葉綠素，不分根、莖葉的真核細胞型微生物。

一、真菌的形態(tài)特性（一）單細胞真菌呈圓形，如酵母菌。（二）多細胞真菌由菌絲和孢子組成，稱絲狀菌或霉菌。

菌絲和孢子的形態(tài)因菌而異，是鑒定真菌的重要依據(jù)。孢子又分為多種，如葉狀孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。1．酵母型菌落是單細胞真菌的菌落，形態(tài)與細菌菌落相似，較大，表面光滑濕潤柔軟、邊緣整齊，如新生隱球菌。2.類酵母型菌落如白假絲酵母菌，形成假菌絲，伸人培養(yǎng)基中。3．霉菌型菌落是多細胞真菌的菌落。菌落呈棉絮狀、絨毛狀，并產(chǎn)生不同的色素，如皮膚癬菌。2．各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。3．血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。4．膿汁及滲出物。(二)采集標本注意事項1.采集的標本要適宜不同真菌感染應采取不同的臨床標本。懷疑為淺部真菌感染如體癬，應刮取病變邊緣的痂、皮屑，發(fā)癬應取病發(fā)。深部真菌感染應取血液、腦脊液、膿汁等。3．采集的標本量要足血液和腦脊液標本5ml，胸腔液20ml，皮屑標本兩塊，活體組織兩份(一份送病理科檢查，一份作鏡檢和培養(yǎng))。4．嚴格無菌操作并進行消毒處理，尤其是采集血液和腦脊液標本，要避免污染雜菌。5．采集標本立即送檢深部真菌標本最長不得超過2h。第三節(jié)真菌檢驗一、標本直接檢查

(一)顯微鏡檢查直接鏡檢對真菌病的診斷較細菌更為重要。許多真菌標本不需染色即可直接鏡檢，如癬病標本多用KOH濕片檢查法，即取病發(fā)或病損部位皮屑、甲屑置于載玻片上，加1滴10％-20％KOH液，然后加蓋玻片并微微加熱，使標本組織溶解透明，在顯微鏡下可觀察到真菌的孢子和菌絲。③判斷某些真菌種的致病性等,如皮膚癬菌、曲霉等。直接鏡檢也有局限性：①陰性結果不能排除真菌感染；②有假陽性結果。因此，對直接鏡檢可疑結果應作復查或用其他檢驗方法鑒定。(二)抗原檢測

常用的方法有膠乳凝集試驗、ELISA、半定量放射免疫法。均應設對照，防止發(fā)生假陽性和假陰性。用半定量放射免疫法檢測血清、尿液和腦脊液中莢膜組織胞漿菌循環(huán)多糖抗原，可快速診斷。二、真菌的分離培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的惟一方法。培養(yǎng)真菌的溫度為28℃，但深部真菌為37℃。菌落是鑒別真菌的方法。注意以下幾點：①菌落性質：酵母菌還是霉菌；②菌落大小，病原性真菌菌落小，而條件致病性真菌菌落大；三、真菌的生化反應用于主要深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。1.糖(醇)類發(fā)酵試驗37℃孵育，觀察糖發(fā)酵情況。2.同化碳源試驗含菌生理鹽水與已融化的固體同化碳源培養(yǎng)基(45℃)混合，然后在培養(yǎng)基上分別加糖，置25℃孵育觀察結果。若24h后無變化可重復加糖。如能同化周圍有生長圈，否則無生長。五、核酸檢測

醫(yī)學真菌的鑒定手段引入了分子生物學的鑒定方法，從核酸堿基G+Cmol％分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、Southern印跡分析到脈沖場凝膠電泳(PFGE)、PCR指紋、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段測序等。（一)G+Cmol％分類鑒定法

常用熱變性溫度法。原理是DNA加熱變性使堿基氫鍵被打開，雙鏈螺旋變成單鏈，導致核苷酸堿基在260nm紫外吸收明顯增加，完全變成單鏈后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中點值溫度為熱變性溫度（Tm）。若真菌DNA中G+C堿基對含量多，Tm值就高。可直接反映G+C堿基對的絕對含量。計算公式為：G+Cmol％=(Tm-53.9)×2.44(二)真菌核型的脈沖電泳分析

脈沖凝膠電泳技術(PFGE)解決了真菌大分子DNA的分離技術難題。原理：PFGE有兩個方向的電場在設定的脈沖時間里交替變換，使大分子DNA在移動中不斷改變自己的形狀及遷移方向，從而繞過細小的凝膠孔隙而得以分離。較大的DNA分子泳動慢些，較小的快些，有許多因素影響電泳帶型，分離真菌等大分子量的DNA宜用較低電壓和較長脈沖時間。用PFGE分析真菌核型，可直接比較其遺傳背景,從電泳核型差異中進行分類鑒定,又能取得基因結構的基本數(shù)據(jù)，構建出大尺度物理圖譜。(三)隨機擴增多態(tài)性

DNA(RAPD)分析RAPD分析是一種利用隨機合成的單個寡核苷酸引物，通過PCR擴增靶細胞DNA，擴增產(chǎn)物凝膠電泳，分析DNA片段大小和數(shù)量的多態(tài)性，從而比較靶基因差異的一種技術。由于病原性真菌基因組龐大，RAPD分析適用于真菌的鑒定與分類。六、真菌毒素的檢測

真菌產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，可引起急慢性真菌中毒癥，引起消化道中毒癥狀，而且可進入人體內引起病變，如引起肝臟損傷的黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素；引起腎臟損害的桔青霉素；引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的黃綠青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，如黃曲霉毒素與肝癌發(fā)生有關。

檢測真菌毒素