基因工程預(yù)習(xí)課件

基因工程預(yù)習(xí)課件第1頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1.2基因工程的基本

操作程序第2頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四基因工程的目的基因－－

從供體轉(zhuǎn)移到受體的基因，主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因具有調(diào)控作用的因子……第4頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1、獲取目的基因的方法有哪些？一、目的基因的獲取2、什么叫基因文庫，它包括哪些種類？3、用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因需要哪些原料？一是從自然界中已有的物種中分離：二是用人工方法合成?，F(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成第5頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四基因文庫：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸?/p>

基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)第6頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）第7頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子（具有編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）物種間的基因交流基因文庫兩種類型小大無有無有某生物的全部基因基因多少某生物的部分基因可以部分基因可以第8頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四

為什么要構(gòu)建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?基因文庫是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蛭膸炜梢詷?gòu)建所需的目的基因，并且不含有其他基因。直接從含有目的基因的生物內(nèi)提取理論上是可以，但是很麻煩；首先取得目的基因后的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞等操作都需要載體,目的基因片段無法確定是否能直接在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的。一般目的基因都很小，直接提取的話會(huì)含有很多其他片段的基因，難以將他們分離開來。問題第9頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4)從基因文庫中得到目的基因的方法第10頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1、構(gòu)建基因組DNA文庫時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生物體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC第11頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四問題2.什么是內(nèi)含子？3.什么是啟動(dòng)子？1.什么是編碼蛋白質(zhì)序列？編碼蛋白質(zhì)序列是指在具有遺傳效應(yīng)的DNA片段內(nèi)，具有能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯形成一定的氨基酸序列的脫氧核糖核苷酸序列。第12頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四基因a基因b基因c基因d間隔片段：不攜帶任何遺傳信息遺傳信息：具有遺傳效應(yīng)的DNA片段內(nèi)的堿基排列順序?；虻慕Y(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)第13頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因第14頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1.原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn)基因原核基因真核基因結(jié)構(gòu)示意圖非編碼區(qū)組成、作用編碼區(qū)組成、作用轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因功能非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子內(nèi)含調(diào)控序列，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)，調(diào)控序列中有與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。連續(xù)不間隔，編碼蛋白分為外顯子和內(nèi)含子，外顯子是編碼蛋白----間隔成熟的RNA內(nèi)含子，外顯子一起轉(zhuǎn)錄為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)加工（剃除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分）成為成熟的RNA①通過復(fù)制在親代與子代之間傳遞遺傳信息②通過轉(zhuǎn)錄與翻譯表達(dá)遺傳信息（從而決定生物的性狀）。第15頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四

真核生物的基因是由基因編碼區(qū)和非編碼組成，編碼區(qū)內(nèi)又分為外顯子和內(nèi)含子,只有外顯子能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū),能轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的信使RNA,進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。非編碼區(qū)，不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA,不能編碼蛋白質(zhì)，但具有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，最重要的是有位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和下游的非編碼區(qū)。原核生物基因就是編碼區(qū)和非編碼區(qū)。原核生物不能編碼蛋白質(zhì)的序列為非編碼區(qū)，而真核生物則有非編碼區(qū)和編碼區(qū)內(nèi)的內(nèi)含子。所以真核細(xì)胞的基因具有間隔性、不連續(xù)性，是因?yàn)榘ǎ壕幋a區(qū)內(nèi)的外顯子、不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子以及非編碼區(qū)。2.什么是內(nèi)含子第16頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四啟動(dòng)子位于DNA上，屬于基因非編碼區(qū)上游的核苷酸序列。啟動(dòng)子上有與RNA聚合酶結(jié)合點(diǎn)。只有在啟動(dòng)子存在時(shí)，RNA聚合酶才能準(zhǔn)確地識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，并沿著DNA編碼區(qū)正常地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。3.什么是啟動(dòng)子？啟動(dòng)子與起始密碼的區(qū)別：內(nèi)含子沒有遺傳效應(yīng)，起始密碼位于mRNA上，只有兩種：AUG和GUG，既決定一種氨基酸，同時(shí)做肽鏈合成的啟動(dòng)信號(hào)。終止子與終止碼同理。二者對(duì)于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子。第17頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四

2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)穆里斯等人于1988年發(fā)明的。PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。第18頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸引物DNA聚合酶指數(shù)2nDNA復(fù)制第19頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四高溫變性中溫延伸低溫復(fù)性PCR第20頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四在TaqDNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸為原料，進(jìn)行延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。⑤反應(yīng)過程：a.變性(90～95℃):b.復(fù)性（退火）(55～60℃):c.延伸(70～75℃):DNA模板解鏈引物與模板結(jié)合，形成局部雙鏈d.多次重復(fù)第21頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制受生物體遺傳物質(zhì)的控制。

4.PCR不需要ATP,體內(nèi)DNA復(fù)制需要；第22頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增第23頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

.VS.PCR擴(kuò)增DNA母鏈4種

脫氧核苷酸DNA聚合酶（Taq酶）引物（2個(gè)）溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶

DNA增殖4）特點(diǎn):半保留復(fù)制邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制全解旋再?gòu)?fù)制第24頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測(cè)推測(cè)單鏈DNA合成3.人工合成—化學(xué)合成法基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成第25頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四？基因表達(dá)載體包括哪些必需組分？各組分有什么作用？二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建第26頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四基因表達(dá)載體的模式圖基因表達(dá)除含有目的基因外，還需要以下元件：?jiǎn)?dòng)子終止子標(biāo)記基因第27頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端第28頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第29頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四啟動(dòng)(終止)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)(終止)翻譯作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三個(gè)相鄰堿基本質(zhì)啟動(dòng)(終止)子啟始(終止)密碼子第30頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四？什么是轉(zhuǎn)化？將目的基因?qū)胫参?、?dòng)物、微生物細(xì)胞的方法分別有哪些？三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第31頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。第32頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)法受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞原核細(xì)胞第33頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第34頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四適用于單子葉植物基因槍法第35頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第36頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四花粉管通道法適用于被子植物第37頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植顯微注射技術(shù)第38頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理法第39頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)第40頁，共43頁，2023年，2月20日，星期四1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變