免疫組化-雙重染色

免疫組化雙重染色方法和步驟：在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實(shí)踐中，經(jīng)常需要檢測(cè)兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細(xì)胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合;同一切片的再度染色法(先對(duì)第一種抗原染色，陽(yáng)性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對(duì)第二種抗原染色、拍照);兩種酶標(biāo)抗體3又重染色(分別用辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體.用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來(lái)自同一種屬，常有重疊染色);不同種屬來(lái)源的抗體雙重染色。目前，最常用的是最后一種方法。不同種屬來(lái)源的抗體雙重染色，兩種抗體間無(wú)交又反應(yīng).特異性較高，即使細(xì)胞內(nèi)抗原量很少也能檢測(cè)。但是，當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)將妨礙另一種抗原染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應(yīng)用最多的是把SABC法或SP法的實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)兩次，其中兩種不同特異性抗體(可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個(gè)組合)，與一抗對(duì)應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來(lái)。該方法用于石蠟切片時(shí)應(yīng)考慮所選擇的兩個(gè)抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個(gè)抗體的修復(fù)對(duì)另一個(gè)抗體的染色結(jié)果沒(méi)有影響。試劑配制：1、 3%過(guò)氧化氫甲醇：30%H20210ml+純甲醇90ml—充分混勻。2、 0.3%過(guò)氧化氫甲醇：30%H2O21ml+純甲醇99ml—充分混勻。3、 免疫組化專用PBS(pH7.2—7.6):NaCI8.5g+磷酸氫二鈉(無(wú)水)2.8g+磷酸二氫鈉(無(wú)水)0.4g溶于雙蒸水并定容至1000毫升。然后測(cè)pH值使之在7.2—7.6。如果用的是含水磷酸鹽，應(yīng)加上分子式中水的含量。4、 0.3%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：TritonX-100是一種非離子型表面活性劑(或稱清潔劑)，分子量為646.86(C34H62O11)。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。貯存液：30%TritonX-100:TritonX-10028.2ml+0.1mol/LPBS(pH7.3)或0.05mol/lTBS(pH7.4)72.8ml,37°C水浴中2~3h;工作液：0.3%TritonX-100:30%TritonX-1002ml用0.1mol/LPBS(pH7.3)或0.05mol/lTBS(pH7.4)定容至200ml。5、 檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)：BosterAR0024按說(shuō)明配制。6、 封閉液：BSA+與第二抗體同源血清+免疫組化專用PBS，使BSA濃度為3%,與第二抗體同源血清濃度為10%。例：BSA0.6克，第二抗體同源血清2毫升，加免疫組化專用PBS定容至20毫升。7、SABC:按說(shuō)明配制。

8DAB（Diaminobenzidine）顯色液：按說(shuō)明配制。9、1%鹽酸-乙醇分化液：濃鹽酸1ml+70%乙醇99ml。SABC法：W￡審QtfH溫冊(cè)聯(lián)堆2Qrlilri圳焙后*fiP?AWM的二甲華中-W3EIl￡imin月見(jiàn)蠟tfl水化理瓷好fin頁(yè)曲血鑾筑蓋ifliRTE尙即廉魄池利甩千證濃池.邑只防止千片旳聞靈話事振.天乓編可CAffrl晴幾知神.帽圧”丟耳較凈的話曲■通斗理曲AWHJ間」二IS1min1AJQ%己畔T5min旨min95^Z.Ks2min90%^892minao%z,o2min70%&gS2min藝屈水（＞N謝次d；Xtfl加妞胸的通適性0,3%的TritonX-10020min如胞腹抗is可PBS濫洗呂min（2甘f砍乂耳涼＞封呦內(nèi)彗性過(guò)■化迥隔3%誼*i此殂甲畔10rnin驗(yàn)0.3%這和化儀甲畔3Dmin2?/^x3^PBS潦洗6min(2ft/J5tx3S?)微眩15陽(yáng)扌伽修負(fù)（關(guān)臟牢毎）4Simin微泯S1檔加熱至沸IH；瞇N中低檔iomin*品寺溫廈在9弓弋“陰9;lfi后辰溫30min1^自般凈卸蔽壇水（＞2矽慮x3衣PBS漂洗30m4n(37XTEffi】浦紙囁干加1周囲的PRE曲居馬上向坦坦畫(huà)加対血加一fit燉出酬穂釋JB的一抗過(guò)廢｛週鷺甲”*迂冰躍）用含3%B5A利It昭dl；?與幣二折悴回瀝》的PBS按說(shuō)昭稀稗一抗.吹岀黠軸片,柚,嘅水城岳園啦干耳正向也壊聞翻口圧13的血奔.漓加秫需后的-抗”如蟲(chóng)僦對(duì)膽靈臉.就注對(duì)輛的盥上力QPB&?抗協(xié)濃腹需珈素”皿斗SEin(37P品艷)切片從4-G^aSSiAPBS扇睨片j貝退曬折廊煩擁結(jié)吉■想足°加二抗PBS需洗6min(2^/^K3S：)PBS預(yù)淺硼少耳贈(zèng)辱性反應(yīng)瞬后的二￡130min（弍了弋溫箱）之前阪＜紙盡園啪干正團(tuán)組理周彌屋面的PBS」即用型二抗不刪PBS瀟速Gmin(2S/?Sx3次)加SABC彌加SABC適變30min(37Xi￡fi)之雨陽(yáng)水瞬變呱干正面理H周圉和反面的PBS」SABC按說(shuō)瞬配制Pbs漂洗15min（5好倔君籾】flfi□AB呂色劑5min(3~10mm)(￡￡)之飾呱水瞬變呱干正面螂RI1圉和反面的PBS按說(shuō)明配DA8顯邑剤,觀配現(xiàn)用.在30甘神內(nèi)瞬rDAB致臥建軸下控制反應(yīng)酗」貿(mào)邑時(shí)間達(dá)到鼻愉ft設(shè)下見(jiàn)陽(yáng)性染色明顯怛背晟不盂劇用PBS洗玄顯色眩斗姥止展應(yīng)PBS9min〔卻分欲曲次丨蘇木蠶復(fù)卿間需要理議,尤其劉雎染售跡細(xì)咆篠上時(shí).醉敏flffi性染色._粗胞樓逼白連仇秒.胞漿或鋤塑自染20秒沖i頓顯盡歸下碣.細(xì)胞艇色，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色為宜.翻胞核竝過(guò)漆.用L%1&駁乙疇港液曲色期渺」自乘水鮭?耐水Smiin5S—2min(-?205)5mmPBSEmin70%SB2min在二甲苯中.若焰婦切片上出現(xiàn)白色云霍r酈冃林不廉r應(yīng)童新在新前100%乙欝中期＜.80%Z；B2min90%SB2min2min100%^E9I2mmioo%&@n2minSffi二押2mm二曲口2min封片中mats從二甲苯中取出切片.擁干陽(yáng)間團(tuán)的二甲苯.用中刪膠當(dāng)在輕育電.再用漕需蓋璇片蓋上.要制螂一閔r務(wù)后輕輕放下另一器，Uft產(chǎn)生氣剋*封好片子后爵于通鳳柜中晾干.注意事項(xiàng):1、片子著色不均勻的原因如下：脫蠟不充分：可以60°C烤20min，立即放入新鮮的xylene1;水化不全：應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；抗體沒(méi)混勻：用移液器充分混勻一抗／二抗等試劑；抗體孵育時(shí)，切片放傾斜；抗體孵育后PBS沖洗不充分；制片厚薄不均勻等問(wèn)題：染片盒不平，切片傾斜。2、切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗／二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制；一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，易增強(qiáng)非特異性著色。SP法1~6步驟與SABC法相同，但無(wú)需使用生物素阻斷劑：切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C過(guò)夜孵育后，PBS沖洗3次，每次5分鐘滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘;滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘堿性磷酸酶顯色液（BCIP/NBT）顯色（紫藍(lán)色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加0.05%鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）;滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37~C孵育10分鐘;滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體）,4~C過(guò)夜孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘過(guò)氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘蘇木精復(fù)染細(xì)胞核;18.水溶性封片劑封片。在使用SP法雙重染色之前需要對(duì)待測(cè)抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)設(shè)計(jì)。購(gòu)買免疫組化雙染試劑盒時(shí);應(yīng)選擇與設(shè)計(jì)方案相同的配套試劑。在選擇一抗時(shí)應(yīng)避免定位在細(xì)胞的