實(shí)驗(yàn)六的連接重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選

實(shí)驗(yàn)六的連接重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選第1頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四一、概述如果要克隆較小的DNA片段（<10kb），質(zhì)粒要比其他任何載體都好，在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，其基本過程是，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段，然后在體外使兩者相連接，再用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。1．外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略：A.帶有非互補(bǔ)突出端的片段：用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易可克隆的DNA片段。一般情況下，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。第2頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四1．外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略B.帶有相同的粘性末端的片段：用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能產(chǎn)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都有可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度，以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還通過將載體DNA的5‘端去磷酸化，最大限度的抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。第3頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四1．外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略C.帶有平末端的片段

由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。通常還需加入低濃度的聚乙二醇（PEG8000），以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體物質(zhì)而提高轉(zhuǎn)化效率。第4頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四2．pBS重組質(zhì)粒的篩選原理因pBS帶有Ampr基因而外源片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pBSDNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來；而只帶有自身環(huán)化的外源片段轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(diǎn)，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能，E.coliDH5菌株帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下，pBS和DH5融為一體的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間可以實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫-互補(bǔ)。第5頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四2．pBS重組質(zhì)粒的篩選原理由-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌較易識別，它在生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的存在下被IPTG（異丙基硫代--D-半乳糖苷）誘導(dǎo)形成蘭色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會導(dǎo)致讀碼框架改變，表達(dá)蛋白失活，產(chǎn)生的氨基酸片段失去-互補(bǔ)能力，因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。因此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。此為-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。第6頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四二、操作步驟第7頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四1．連接反應(yīng)取新的經(jīng)滅菌處理的0.5mleppendorf管，編號。將0.1ug載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量（可稍多）的外源DNA片段。加蒸餾水至體積為8ul，于450C保溫5分鐘，以使重新退火的粘端解鏈。將混合物冷卻至00C。加入10XT4DNA連接酶緩沖液1ul、T4DNA連接酶0.5ul，混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底，于16℃保溫8-24小時，同時做兩組對照反應(yīng)，其中對照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質(zhì)粒載體。第8頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四2、細(xì)胞轉(zhuǎn)化將-70℃下保存的感受態(tài)細(xì)胞（200l），室溫下解凍后放置于冰上。將pBS質(zhì)粒DNA溶液（不超過50ng），體積不超過10l，輕輕搖勻，冰上放置30min。42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴中5min,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min.向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃下震蕩培養(yǎng)1小時使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）.取上述菌液100l涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，等菌液完全干后倒置平皿37℃下培養(yǎng)16-24小時，出現(xiàn)明顯而未相互重疊的單菌落。培養(yǎng)后，將平皿于４℃下放置數(shù)小時，使顯色完全。對照1：以蒸餾水代替pBS質(zhì)粒DNA，其它同上。對照2：以蒸餾水代替pBS質(zhì)粒DNA，在步驟E中，取5l涂布于不含Amp的篩選平板上。第9頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四３.重組子篩選不帶有ｐB(yǎng)S質(zhì)粒DNA的細(xì)胞，由于無amp抗性，不能在含有amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有ｐB(yǎng)S載體的轉(zhuǎn)化子由于具有-半乳糖苷酶活性，在X-gal和IPTG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落(在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落)。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于失了-半乳糖苷酶活性，在麥康凱選擇性培養(yǎng)基及X-gal和IPTG培養(yǎng)基上均為白色菌落。酶切鑒定重組質(zhì)粒：用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含50ug/mlAmp的5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時。使用煮沸法抽取的pBS質(zhì)粒做對照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時遷移率較pBS慢。再用與連接末端相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗(yàn)。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。第10頁，共11頁，2023年，2月20日，星期四３.重組子篩選計(jì)算：轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)X轉(zhuǎn)化反應(yīng)總體積/涂