(4.5)-第三章酶的提取與分離純化

酶的分離工程

將酶從生物細(xì)胞或培養(yǎng)物等含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，從而獲得能夠滿足使用需求的一定純度的酶的過程。

預(yù)處理（pretreatment）：包括發(fā)酵液性質(zhì)改變和固液分離等。

酶的提?。╡xtraction）：酶充分轉(zhuǎn)入溶劑的過程。

粗分級(jí)分離（roughfractionation）：除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)。

細(xì)分級(jí)分離（finefractionation）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。

濃縮、干燥與結(jié)晶（concentration,desiccationandcrystalization）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。

第三章酶的提取與分離純化本章內(nèi)容

發(fā)酵液的預(yù)處理

酶的提取

酶的分離純化

成品加工

酶分離純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液的成分：細(xì)胞個(gè)體及碎片未利用的培養(yǎng)基細(xì)胞代謝產(chǎn)物預(yù)處理的目的：改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)除去部分雜質(zhì)黏度高，雜質(zhì)多，酶含量低且不穩(wěn)定一、發(fā)酵液的預(yù)處理1.影響發(fā)酵液固液分離的因素（過濾為主）

細(xì)胞類型

發(fā)酵液的黏度二、發(fā)酵液的固液分離二、發(fā)酵液的固液分離2.固液分離的目的胞外酶：除去固體雜質(zhì)和細(xì)胞，收集水相胞內(nèi)酶：除去水相，收集細(xì)胞3.固液分離的常用方法過濾離心膜分離一、細(xì)胞破碎二、酶的提取第二節(jié)酶的提?。ㄒ唬┘?xì)胞壁及細(xì)胞膜組成

細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖（N-乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸）、脂質(zhì)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)霉菌：多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）植物細(xì)胞：纖維素和果膠

動(dòng)物細(xì)胞：細(xì)胞膜（磷脂雙分子層）一、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）

機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法酶促破碎法微波破碎法

可聯(lián)用

（二）細(xì)胞破碎的方法1.機(jī)械破碎法

勻漿法搗碎法研磨法（二）細(xì)胞破碎的方法2.物理破碎法超聲波法壓力差法

滲透壓變化法高壓沖擊法突然降壓法溫度差法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。（二）細(xì)胞破碎的方法————————————————————細(xì)胞超聲機(jī)械滲透壓溫度————————————————————?jiǎng)又参?+++++++++++革蘭氏陰性菌++++++++革蘭氏陽(yáng)性芽孢菌++++++酵母++++革蘭氏陽(yáng)性球菌+-++菌絲-++-++孢子----細(xì)胞對(duì)破碎方法的敏感性3.化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。

有機(jī)溶劑：破壞磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

表面活性劑：與磷脂和脂蛋白作用，常用非離子型表面活性劑，如TritonX-100，Tween等。（二）細(xì)胞破碎的方法低溫下，防止變性！4.酶促破碎法

自溶法：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)生溶解的現(xiàn)象。

外加酶法：根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿浮Ｈ绾胃鶕?jù)細(xì)胞壁特點(diǎn)選擇酶？？（二）細(xì)胞破碎的方法

例：細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

破壁時(shí)需加EDTA溶菌酶1.直接測(cè)定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。2.測(cè)定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測(cè)定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)小結(jié)：細(xì)胞破壁方法及原理

酶的抽提：在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶入溶劑的過程。

目標(biāo)：將目的酶最大限度地溶解出來；保持生物活性。

注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫（0~10℃）操作。

原則：相似相溶；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值二、酶的提取（extraction）（1）鹽溶液提取法（鹽溶，saltingin）常用低濃度鹽溶液（0.02-0.5mol/L，常用NaCl、磷酸鹽等），對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大。1.提取方法1.提取方法（2）酸、堿溶液提取法在酸（pH2-6）、堿（pH8-12）溶液中溶解度大、穩(wěn)定性好的酶（3）有機(jī)溶劑提取法與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多非極性基團(tuán)的酶有機(jī)溶劑（與水互溶）：低級(jí)醇、丙酮、苯酚2.影響提取的主要因素（1）溫度溫度升高，酶的溶解度增加，溶解速率加快溫度過高，酶易變性失活

低溫提?。阂话?-10攝氏度（2）pH

遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，防止酶沉淀

不宜過高過低，防止變性失活（3）提取液體積

原料體積的3-5倍為宜，不宜過多其他因素：攪拌、時(shí)間、保護(hù)劑等小結(jié)：酶的提取方法第三節(jié)

酶的分離純化一、沉淀分離二、離心分離三、過濾與膜分離四、層析分離五、電泳技術(shù)一、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）

初步分離：使酶（或雜質(zhì)）由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀?/p>

常用方法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法選擇性變性沉淀法（熱變性和酸堿變性）等電點(diǎn)沉淀法其他沉淀法（一）鹽析沉淀法1.鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。穩(wěn)定因素：水化膜、表面電荷常用：硫酸鹽、氯化鈉、磷酸鹽等

鹽濃度的調(diào)整（以硫酸銨為例）①

飽和溶液法：滴加飽和硫酸銨溶液②固體鹽添加法：添加硫酸銨固體注意：鹽析得到的沉淀再溶解后應(yīng)用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。1.鹽析過程分段鹽析：不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出。1.鹽析過程2.鹽析的影響因素

S：離子強(qiáng)度為I時(shí)的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）

S0：離子強(qiáng)度為0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。Ks代表鹽析效率，表示隨著鹽濃度的增加蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。①離子強(qiáng)度②蛋白質(zhì)濃度：過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。③

pH值：

等電點(diǎn)處最易沉淀。④溫度：一般可在室溫下進(jìn)行，某些對(duì)溫度敏感的酶可在低溫下操作。2.鹽析的影響因素利用酶與雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1.沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2.常用有機(jī)溶劑（與水互溶）丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右。

（二）有機(jī)溶劑沉淀法3.作用特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高沉淀不需脫鹽溶劑易揮發(fā)，沉淀易分離缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，必須低溫操作，沉淀后立即用水或緩沖液溶解有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。

（二）有機(jī)溶劑沉淀法4.影響因素①溫度低溫，有機(jī)溶劑預(yù)冷②pH等電點(diǎn)附近③蛋白質(zhì)濃度1.原理蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)

2.使用方法邊滴加邊攪拌，防止局部過酸過堿引起酶分子變性（三）等電點(diǎn)沉淀法單獨(dú)使用等電點(diǎn)沉淀法能否使目的蛋白從反應(yīng)體系中完全沉淀出來？可以不可以AB提交單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白）多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。單選題1分選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。1.熱變性（耐高溫酶）加熱使改變蛋白結(jié)構(gòu)，破壞水化層，使雜蛋白變性沉淀而保留目的酶在溶液中。2.pH變性改變體系pH值使雜蛋白變性3.有機(jī)溶劑變性使對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。（四）選擇性變性沉淀法1.作用機(jī)理與有機(jī)溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。2.沉淀劑：非離子有機(jī)聚合物和聚電解質(zhì)常用：聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡(jiǎn)寫PEG），多用分子量大于4000的PEG。3.優(yōu)點(diǎn)操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。（五）其他沉淀法（復(fù)合沉淀法）小結(jié)：酶的沉淀分離借助于離心機(jī)產(chǎn)生的離心力分離不同大小、不同密度的物質(zhì)（一）基本原理1.離心力

Fc=mac=mrω2=mr(2N/60)2

N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)

（r/min，rpm）表示方法一二、離心分離（centrifugation）Fc通常以相對(duì)離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力）的多少倍，一般用g（或數(shù)字g）表示RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速N之間的關(guān)系

低速離心：以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000rpm

高速離心（超速）：常以相對(duì)離心力（RCF）表示，如：65000g。表示方法二二者如何選擇？二、離心分離（centrifugation）2.沉降系數(shù)（sedimentationconstant）

單位離心力下顆粒的沉降時(shí)間，用S表示。

與分子量、分子密度成正比由于許多生物大分子的S值很小，所以定義1013s為一個(gè)沉降單位，1S=11013s。

常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。二、離心分離（centrifugation）（二）離心機(jī)的種類二、離心分離（centrifugation）名稱轉(zhuǎn)速(r/min，g)注意事項(xiàng)低速離心機(jī)80001×104常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡高速離心機(jī)

8000-250001×104-1×105冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡超速離心機(jī)

>25000>1×105冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)溫度類型：常溫及冷凍使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式二、離心分離（centrifugation）（三）離心的形式角式水平式二、離心分離（centrifugation）離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。二、離心分離（centrifugation）使用離心機(jī)時(shí)，應(yīng)注意：平衡定溫定速定時(shí)ABCD提交（四）離心機(jī)操作多選題1分（五）常用離心方法

差速離心沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法：等密度梯度離心常用，各類離心機(jī)均可超速離心二、離心分離（centrifugation）

低速與高速離心交替進(jìn)行，使沉降系數(shù)不同的顆粒分批分離的方法。

適用：分離分子量和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。

缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重，沉降的顆粒受到擠壓。

用途：粗制品提取1．差速離心（differentialcentrifugation）差速離心實(shí)例

不同離心時(shí)間離心效果示意圖（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時(shí)間后顆粒的沉降情況又稱速度區(qū)帶離心樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使各組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

密度梯度介質(zhì)：梯度介質(zhì)溶解在一定的溶劑中，從而在離心管內(nèi)形成一定的密度梯度。常用密度梯度溶液：蔗糖溶液，梯度預(yù)先配制。適用于超速離心機(jī)2.密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）

步驟：形成密度梯度，加樣，離心，收集樣品2.密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）

密度梯度離心示意圖

特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度范圍小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適用：分離密度相近而大小不同的物質(zhì)?？刂疲涸诜肿恿孔畲蟮念w粒沉淀之前停止離心，可適當(dāng)增大離心力，減少離心時(shí)間，防止區(qū)帶擴(kuò)散用途：分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基等成分2.密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）2.密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。

常用密度梯度溶液：銫鹽溶液，梯度自發(fā)形成。適用于超速離心機(jī)3.等密度梯度離心

特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度范圍包含樣品物質(zhì)顆粒的密度適用：分離大小相近而密度不同的物質(zhì)控制：離心速度和時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)3.等密度梯度離心

二、離心分離（centrifugation）（六）離心條件的確定離心力：RCF=1.1210-5N2r

離心時(shí)間：t=K/S

轉(zhuǎn)子因子：K=(lnr2-lnr1)/ω2=Stt：沉降時(shí)間（s）S：顆粒沉降系數(shù)

ω：轉(zhuǎn)子角速度

溫度：多為4攝氏度

pH：酶穩(wěn)定，無腐蝕二、離心分離（centrifugation）

過濾：借助過濾介質(zhì)將不同大小、形狀和特性的物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)。

分類：

非膜過濾：粗濾、微濾

膜過濾：微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析三、過濾與膜分離過濾的分類及特性三、過濾與膜分離1.非膜過濾采用高分子膜以外的材料（濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等）作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)2.膜過濾采用一定孔徑的高分子薄膜作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)分類：加壓膜分離：微濾、超濾、反滲透電場(chǎng)膜分離：電滲析、離子交換電滲析擴(kuò)散膜分離：透析（1）加壓膜分離①微濾：微孔濾膜特點(diǎn)：截留直徑為0.2-2μm的顆粒過濾除菌常用（1）加壓膜分離②超濾：超濾膜

特點(diǎn)：截留直徑為20?

-0.2μm的顆粒超濾裝置——實(shí)驗(yàn)室裝置超濾裝置——工業(yè)裝置中空纖維系統(tǒng)超濾膜包超濾裝置③反滲透：反滲透膜在高于溶液滲透壓的作用下，依據(jù)其他物質(zhì)不能透過半透膜而將其分離的技術(shù)。特點(diǎn)：截留直徑<20?

的顆粒2.電場(chǎng)膜分離使小分子的帶電物質(zhì)或離子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)并透過半透膜的分離技術(shù)（1）電滲析（2）離子交換膜電滲析脫鹽3.擴(kuò)散膜分離——透析（dialysis）利用分子擴(kuò)散作用使溶質(zhì)分子從高濃度一側(cè)通過透析膜向低濃度一側(cè)移動(dòng)的分離技術(shù)主要用于除鹽（1）透析膜特點(diǎn)：①

多孔薄膜，允許小分子通過，阻止大分子通過②化學(xué)惰性，多種溶液中不溶解（材料：纖維素衍生物等）③一定的機(jī)械強(qiáng)度透析膜規(guī)格選擇：截留分子量（范圍）、壓平寬度（2）透析方法及裝置色譜起源色譜組分植物色素石油醚碳酸鈣顆粒用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。四、層析分離（色譜法，Chromatography）四、層析分離利用各組分的理化性質(zhì)的不同，使各組分以不同比例分布在兩相（固定相、流動(dòng)相）中，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而使不同組分得到分離純化的技術(shù)。理化性質(zhì)：相對(duì)分子質(zhì)量、形狀、吸附力、親和力、分配系數(shù)、等電點(diǎn)等柱層析（ColumnChromatography）自動(dòng)核酸蛋白

液相色譜分析儀自動(dòng)核酸蛋白

液相色譜分析儀蠕動(dòng)泵（恒流泵）層析柱紫外檢測(cè)儀記錄儀部分收集器低溫層析柜現(xiàn)代化層析設(shè)備

——AKTA記錄系統(tǒng)良好的線性放大四、層析分離凝膠層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析蛋白液相層析層析聚焦又稱凝膠過濾層析、凝膠滲透層析、分子篩層析、分子排阻層析等以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子質(zhì)量、形狀不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。（一）凝膠層析（gelchromatography）1.基本原理大分子物質(zhì)：不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先流出層析柱小分子物質(zhì)：可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱（一）凝膠層析（gelchromatography）（一）凝膠層析（gelchromatography）凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Ka表示：

Ve-VoKa=————Vi

Vo：外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積

Vi：內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和

Ve：某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出層析柱，且色譜峰達(dá)到最高值時(shí)的洗脫液體積（一）凝膠層析（gelchromatography）

凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰：Ⅰ.Ka=0，即Ve=Vo：說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅲ.Ka=1，即Ve=Vo+VI：說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。Ⅱ.0<Ka<1：因分子大小而改變洗脫峰的位置，Ka小的先流出，Ka大的后流出。

分配系數(shù)Ka的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Ka差異大，分離效果好，Ka差異小，分離效果差。思考：Ka>1??體系中存在其他層析（吸附層析、離子交換層析等）（一）凝膠層析（gelchromatography）2.凝膠的種類和性質(zhì)——多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextrangel)瓊脂糖凝膠（agarosegel)聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）（一）凝膠層析（gelchromatography）3.凝膠過濾層析的操作（1）凝膠的選擇和處理（2）層析柱的選擇（3）裝柱（4）上柱（5）洗脫（6）膠的保存（一）凝膠層析（gelchromatography）91（一）凝膠層析（gelchromatography）4.應(yīng)用脫鹽溶液濃縮生物大分子物質(zhì)的分離純化分子量的測(cè)定（一）凝膠層析（gelchromatography）

利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各離子的親和力不同進(jìn)行分離的技術(shù)。（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）1.基本原理（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）2.離子交換劑由載體、可解離基團(tuán)（電荷基團(tuán)和反離子）構(gòu)成纖維素瓊脂糖葡聚糖

樹脂

載體

電荷基團(tuán)

—O—CH2—COO-—H+反離子（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）（1）離子交換劑的類型陰離子交換劑：二乙氨基乙基DEAE－C2H4N+(C2H5)2H二乙氨基乙基2-羥丙基QAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3陽(yáng)離子交換劑：羧甲基CM—CH2COO－磺丙基SP—C3H6SO3－（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）

化學(xué)原料合成：樹脂類物質(zhì)

載體天然材料制成：cellulose、sephadex、sepharose

陽(yáng)離子交換劑：電荷基團(tuán)（－）,反離子（＋）

可解離基團(tuán)

陰離子交換劑：電荷基團(tuán)（＋）,反離子（－）

例：DEAE-Sephadex，CM-Sepharose（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）（2）離子交換劑的選擇

強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)型：適用的pH范圍廣弱型：適用的pH范圍窄

陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若<pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽(yáng)離子交換劑若>pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）（3）平衡常數(shù)K（分配系數(shù)）組分離子在離子交換劑上的濃度（mol/g）K=組分離子在溶液中的濃度（mol/mL）衡量離子交換劑的活性基團(tuán)與組分離子的親和力K值越大，親和力越大，越易被離子交換劑吸附，在體系內(nèi)保留時(shí)間越長(zhǎng)根據(jù)K值之間的差異進(jìn)行分離（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）3.操作平衡上柱（沖平）去吸附分離結(jié)束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）4.應(yīng)用：制備純化生物大分子5.影響離子交換層析的主要因素pH離子強(qiáng)度：分離樣品需經(jīng)脫鹽處理層析介質(zhì)（流速、分辨率）（二）離子交換層析（ionexchangechromatography,IEC）又稱疏水作用層析

疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì)，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。（三）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography）讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁，或讓蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水性殘基暴露出來。在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部結(jié)構(gòu)可逆改變，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，通過降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按結(jié)合力大小依次進(jìn)行解吸附?；驹恚ㄈ┦杷畬游觯℉ydrophobicInteractionChromatography）

2.吸附劑：基質(zhì)+配體

親水性（如Sepharose）

基質(zhì)疏水性（如硅膠、樹脂）

配體（疏水性基團(tuán)）：丁基、苯基、辛基、烷基（三）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography）3.操作加樣：樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。再生：除去固定相吸附的雜質(zhì)，用水或8mol/L脲素溶液。4.應(yīng)用主要用于分離純化大分子物質(zhì)（與離子交換層析互補(bǔ)）。（三）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography）與離子交換層析比較？1.基本原理利用固體吸附劑對(duì)不同組分間吸附力（及洗脫液對(duì)它的解吸作用）的差異進(jìn)行分離。（四）吸附層析（adsorptionchromatography）吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。（四）吸附層析（adsorptionchromatography）2.吸附劑根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭根據(jù)材料分為：無機(jī)吸附劑/有機(jī)吸附劑（四）吸附層析（adsorptionchromatography）3.洗脫劑極性組分：極性洗脫劑非極性組分：非極性洗脫劑注意：純度高、穩(wěn)定性好、溶解度大、流動(dòng)性好4.洗脫方法溶劑洗脫法：?jiǎn)我?混合溶劑洗脫置換洗脫法：置換劑取代洗脫前緣洗脫（分析）法：待分離溶液洗脫（四）吸附層析（adsorptionchromatography）相似相溶原理由吸附層析發(fā)展起來的，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱：

功能層析（functionchromatography）

生物專一吸附（biospecificadsorption）

選擇層析（selectivechromatography）（五）親和層析（AffinityChromatography）1.基本原理利用生物大分子與配體之間的特異性的、可逆的親和力，對(duì)生物分子進(jìn)行純化。2.特點(diǎn)分辨率高，分離速度快操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求不高親和吸附劑通用性差，價(jià)格高洗脫條件苛刻（五）親和層析（AffinityChromatography）（五）親和層析（AffinityChromatography）+CCC配體蛋白質(zhì)配基固相化親和吸附固體載體解吸附3.親和層析劑（1）載體的選擇

常用載體：瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素等。（2）配體的選擇

常用配體：抑制劑、底物、抗體、輔酶等。

優(yōu)良配體須具備的條件：①與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。②具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。（五）親和層析（AffinityChromatography）目的產(chǎn)物

相應(yīng)的配體

酶抗體凝集素激素DNA/RNA底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體受體、載體蛋白互補(bǔ)片段目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配體（五）親和層析（AffinityChromatography）（3）偶聯(lián)（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體①載體活化不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。（五）親和層析（AffinityChromatography）②引入連接臂（spacearm）——連接小分子物質(zhì)

又稱手臂（spacer）

“接臂”的目的：克服影響配體與生物大分子的結(jié)合的空間障礙。

“接臂”的途徑：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如：AH-Sepharose4B（五）親和層析（AffinityChromatography）常用手臂（五）親和層析（AffinityChromatography）4.操作（1）層析前：選擇親和層析劑選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配體選擇根據(jù)配體分子大小及基團(tuán)特性載體（2）裝柱、平衡、上樣（3）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑（五）親和層析（AffinityChromatography）

非專一性洗脫改變溫度改變pH值改變離子強(qiáng)度

專一性洗脫：競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物等）

被吸附物質(zhì)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性地與

配體結(jié)合（五）親和層析（AffinityChromatography）5.分類及應(yīng)用（1）純化標(biāo)簽（tag）蛋白——金屬離子親和層析如：帶有His-tag，GST-tag蛋白純化（2）抗體及Fc融合蛋白純化——免疫親和層析

ProteinA：

來源于金黃色葡萄球菌的一個(gè)株系，它含有5個(gè)可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域

ProteinG：源自鏈球菌G族的細(xì)胞表面蛋白，為三型Fc受體。作業(yè)1：作用原理作業(yè)2：作用原理（五）親和層析（AffinityChromatography）PrinciplesofOperationforChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度（遷移率）的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)。用途：酶的純度鑒定、分子量測(cè)定、等電點(diǎn)測(cè)定、少量酶的分離純化1.基本原理在一定pH條件下，不同帶電性質(zhì)、帶電量、顆粒大小和形狀的顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和速度（遷移率）不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。+-五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）（1）遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)

內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小形狀）

外界條件：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性（2）影響遷移率的因素

顆粒性質(zhì)：體積越小，越接近球形，靜電荷越多

電場(chǎng)強(qiáng)度：越高

溶液性質(zhì)：離pI越遠(yuǎn)；離子強(qiáng)度越高五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）界面電泳（又稱移動(dòng)界面電泳，movingboundaryelectrophoresis，MBEP）：在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis，ZEP）：有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用：防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散。2.分類五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）③瓊脂糖凝膠電泳一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。④聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)，分辨率較高。

聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）3.電泳常用設(shè)備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。常壓電泳儀（600V）高壓電泳儀（3000V）超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設(shè)備五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳思考：電泳后得到的蛋白條帶能否回收？如何回收？五、電泳技術(shù)（electrophoresis，EP）（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。1.基本原理丙烯酰胺單體（acrylamide，Acr）交聯(lián)劑：N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）2.分離效應(yīng)PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）：采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）：采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖系統(tǒng)

電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)

濃縮效應(yīng)連續(xù)PAGE（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

濃縮效應(yīng)：樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，再進(jìn)入分離膠分離。

電荷效應(yīng)：分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。

分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。

HCl、甘氨酸作用？目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（molecularweight,Mw）的最好方法。（二）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）1.基本原理

巰基乙醇：還原二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

SDS：帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過天然蛋白質(zhì)原有的電荷，因而消除或掩蓋不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS：破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMw=lgK-bmMw：分子量；m：遷移率；K、b均為常數(shù)（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）2.操作：（SDS及PAGE）制膠:分離膠/濃縮膠樣品制備：PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖/甘油、溴酚藍(lán)）SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS、甘油、

巰基乙醇、溴酚藍(lán)）。加樣及電泳：加入電泳緩沖液，加樣，通電，溴酚藍(lán)距下端一定距離時(shí)停止電泳。染色及脫色（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，在其中加入兩性電解質(zhì)載體的電泳方法。

1.基本原理兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng)，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)2.兩性電解質(zhì)載體（carrierampholytes）（1）易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度（2）導(dǎo)電性能好——以保持電場(chǎng)強(qiáng)度的均勻性。（3）分子量小——電泳后易分離除去。（4）化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測(cè)定。（5）性質(zhì)穩(wěn)定——不與樣品發(fā)生反應(yīng)。商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pH梯度的小分子混合物（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)3.操作：

凝膠配制：兩性電解質(zhì)載體濃度為2.5％~5%

加樣：凝膠表面任意位置，或制膠時(shí)加入

電泳：

陽(yáng)極：磷酸溶液電極溶液陰極：NaOH溶液只有在凝膠兩端給予高電壓（600V）和足夠的電泳時(shí)間（12h）時(shí)，才能獲得較好的分辨率。（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)固定及染色：TCA固定，考馬斯亮藍(lán)染色。（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)3.應(yīng)用：等電點(diǎn)測(cè)定Marker與未知樣品同時(shí)電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)未知蛋白遷移距離可推知pI。IEF測(cè)定蛋白質(zhì)pI（三）等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)第四節(jié)酶的成品加工酶的濃縮酶的干燥酶的結(jié)晶（一）蒸發(fā)濃縮（易變性，較少使用）

減壓蒸發(fā)濃縮的簡(jiǎn)易裝置一、酶的濃縮（酶與溶劑分離）

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（二）超濾濃縮

濃縮以壓力差為動(dòng)力，將待濃縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選擇性透過，達(dá)到濃縮目的。一、酶的濃縮（酶與溶劑分離）

（三）膠過濾濃縮利用葡聚糖凝膠Sephadex、