酶的分離純化優(yōu)秀公開(kāi)課

第四章酶的提取與分離純化將酶從細(xì)胞或發(fā)酵液中取出，再與雜質(zhì)分開(kāi)，獲得所需的酶產(chǎn)品。酶的分離純化工作,是酶學(xué)研究的基礎(chǔ).酶的純化過(guò)程就目前而言,還是門(mén)實(shí)驗(yàn)科學(xué).酶的純化過(guò)程與一般蛋白純化過(guò)程相比有本身獨(dú)有的特點(diǎn):一是特定的一種酶在細(xì)胞中含量很少;二是酶可通過(guò)測(cè)定活力的方法加以跟蹤.1、建立一個(gè)可靠和快速的測(cè)活方法；2、酶原料的選擇；3、酶的提取；4、酶的提純；5、酶的純度檢驗(yàn)。酶分離純化的一般原則:第一節(jié)細(xì)胞破碎（link)第二節(jié)酶的提取(link)第三節(jié)沉淀分離(link)第四節(jié)離心分離第五節(jié)過(guò)濾與膜分離第六節(jié)層析分離第七節(jié)電泳分離

第八節(jié)萃取分離第九節(jié)酶的結(jié)晶第十節(jié)濃縮與干燥本章主要內(nèi)容:go細(xì)胞的破碎方法：一、機(jī)械破碎法二、物理破碎法三、化學(xué)破碎法四、酶學(xué)破碎法back原理：機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪力作用于細(xì)胞1機(jī)械搗碎法：搗碎機(jī)，10000rpm，實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)規(guī)模均可2研磨法：研缽、石磨、球磨、細(xì)菌磨等研磨器械，效率較低3勻漿法：勻漿器，用于顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞破碎程度高。對(duì)酶破碎少，難于工業(yè)化。Back一、機(jī)械破碎法包括:1、溫度差破碎法;2、壓力差破碎法;3、超聲波破碎法;二、物理破碎法通過(guò)溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎2、壓力差破碎法高壓沖擊法用活塞或沖擊錘加高壓沖擊菌體細(xì)胞和冰晶石英沙等混合物。突然降壓法加壓至30MP以上，打開(kāi)出口閥突然降為常壓爆破性減壓法用氮?dú)饣蚨趸汲鋲褐翈资翈装俅髿鈮骸B透壓差法利用滲透壓的變化而使細(xì)胞破碎，常用于從海洋微生物中提取某些酶。頻率10~20KHz，功率100~150W，溫度0~10oC，pH4~7，時(shí)間3~10min，間隔多次;對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞濃度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz聲波或10～500kHz超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)，只要有設(shè)備該法方便.且效果也好，但一次處理量較小;應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在;處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。3、超聲波破碎法在超聲波的作用下，細(xì)胞膜由于空穴作用而破碎。破壞程度與輸出功率、破碎時(shí)間密切相關(guān)，與頻率關(guān)系不大。操作條件Back三、化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞。有機(jī)溶劑（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過(guò)性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。

1、有機(jī)溶液粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。操作四、酶學(xué)破碎法在一定條件下，通過(guò)外加的酶或細(xì)胞本身存在的酶的作用，使細(xì)胞破碎。簡(jiǎn)單原理:溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類(lèi)。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。1、外加酶1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒(méi)有脫出。蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞用。革蘭氏陽(yáng)性菌：細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形狀依賴于壁上的肽多糖，溶菌酶能專(zhuān)一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷鍵。革蘭氏陰性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其細(xì)胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶；霉菌：其細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)，可用幾丁質(zhì)酶；植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢米陨淼牡鞍酌笇⒓?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過(guò)程中PH顯著變化，隨時(shí)要調(diào)節(jié)pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。適宜的自溶條件：溫度、pH值、離子強(qiáng)度等加入噬菌體感染細(xì)胞電離輻謝2、自溶法Back鹽溶現(xiàn)象:在一定濃度的鹽存在下,酶的溶解度增加.鹽析現(xiàn)象:當(dāng)鹽的濃度太高,蛋白的濃度反而下降,從溶液中析出.一般采用稀鹽溶液，0.02~0.05mol/L。

等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。一、酶提取的主要方法1、鹽溶液提取蛋白質(zhì)提取液的pH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。

2、酸溶液提取、堿溶液提取原則：如細(xì)胞色素C屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提??；肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提?。荒承┑鞍踪|(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇pH3～6范圍對(duì)于分離提取是有利的。二、影響酶提取的主要因素1、溫度為了防止酶變性失活，溫度不宜高；多數(shù)酶的提取溫度在5℃以下；耐溫較高的酶可適當(dāng)提高溫度，以提高酶溶解度和擴(kuò)散速率。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類(lèi)，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。2、pH值為了防止酶的變性，pH不宜過(guò)高或過(guò)低；溶液的pH值應(yīng)遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)，以增加酶的溶解度。3、提取液的體積提取液的用量增加，可提高提取率；過(guò)量，酶濃度降低，不利進(jìn)一步純化。從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)行。主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低.1、粗分級(jí)分離2、細(xì)分級(jí)分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。Back在低鹽濃度下,蛋白質(zhì)和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加鹽溶鹽析鹽濃度升高到一定濃度后,蛋白酶的溶解度又隨著鹽濃度升高而減少,蛋白酶沉淀析出.一旦蛋白質(zhì)溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無(wú)法有效隔離蛋白質(zhì)的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸引，因而沉淀下來(lái)。因此，分子表面上若有越多的非極性區(qū)域，就越容易用硫酸銨沉淀下來(lái)。式中：S、So：蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為I和0時(shí)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，取決于鹽的性質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)I：離子強(qiáng)度,與離子濃度mi和離子價(jià)數(shù)Zi有關(guān)。

I=1/2∑miZi2酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度的關(guān)系式：蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度有密切的關(guān)系β=LogSo：取決于酶的性質(zhì)，也與溫度和pH有關(guān)。Ks：主要取決于鹽性質(zhì)。與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑與溶液介電常數(shù)成反比。β與Ks確定后，蛋白酶溶解度決定于IKs分段鹽析:T、pH一定下改變離子強(qiáng)度β分段鹽析:一定鹽和離子強(qiáng)度下，改變T、pH常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。鹽析所需添加飽和硫酸銨體積式：溫度和pH一定時(shí)，So為常數(shù)，

不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分段鹽析常用的鹽析劑是硫酸銨，因?yàn)樗柠}析能力強(qiáng)，在水中的溶解度大，價(jià)格便宜，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽常用透析法。

透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水中進(jìn)行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質(zhì)被除去。透析袋蛋白質(zhì)溶液蒸餾水利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)（如酶、蛋白質(zhì)、氨基酸等）具有不同的等電點(diǎn)這一特性進(jìn)行分離純化的方法。等電點(diǎn)時(shí)，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶液中除雜和與其它方法聯(lián)系使用。二、等電點(diǎn)沉淀法圖例

介電常數(shù)溶質(zhì)分子之間的引力溶解度有機(jī)溶劑溶質(zhì)分子周?chē)乃て茐拿负偷鞍踪|(zhì)的氫鍵破壞空間結(jié)構(gòu)變化形成疏水層三、有機(jī)溶劑的沉淀法利用酶等物質(zhì)在有機(jī)溶液中的溶解度不同而使之分離的方法。介電常數(shù)permittivity亦稱(chēng)相對(duì)電容率。是指在同一容器中用某一物質(zhì)為電介質(zhì)和真空時(shí)的電容的比值。介電常數(shù)通常隨溫度和介質(zhì)中傳播的電磁波的頻率而變。電介質(zhì)的介電常數(shù)越大，極化能力越強(qiáng)；介電常數(shù)越小，絕緣性能越好。用εr表示（1）所析出酶沉淀比鹽析法析出的易于離心分離或過(guò)濾；（2）不含無(wú)機(jī)鹽，適于食品工業(yè)用酶制劑的制備；（3）易于除去或回收。

優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：易于引起酶的變性失活，需低溫操作和沉淀析出后盡快分離。酶+酶沉淀劑復(fù)合物沉淀分離從復(fù)合物中析出酶

四、復(fù)合沉淀法常用的酶沉淀劑：?jiǎn)螌帲尤肓繛槊敢旱?.1~1%。）聚丙烯酸（30~40%）等高分子聚合物五、選擇性變性沉淀使雜蛋白變性沉淀，而酶不受影響；熱穩(wěn)定性好的，可進(jìn)行熱處理；改變pH或加入某些金屬離子使雜蛋白除去；back第四節(jié)離心分離離心：借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、密度的物質(zhì)分離的技術(shù)；要根據(jù)欲分離物質(zhì)及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。1、常速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),相對(duì)離心力(RCF)104g以下,用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)确蛛x；2、高速（冷凍）離心機(jī)1×104-2.5×104rpm，相對(duì)離心力104~105g,用于沉淀、細(xì)胞器等分離；3、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速2.5-8×104rpm，相對(duì)離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)及細(xì)胞器病毒分離純化；檢測(cè)純度；沉降系數(shù)和相對(duì)分子量測(cè)定等。分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機(jī)裝有光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、自動(dòng)記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；一、離心機(jī)的種類(lèi)與用途臺(tái)式高、超速離心機(jī)0.6-10萬(wàn)轉(zhuǎn)/分以上離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地面式）普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬(wàn)轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或更高(分析性超速離心主要用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等)概述所分離的顆粒大小和密度相差較大:常速、高速離心;若從樣品液中分離2種以上大小和密度不同的顆粒：差速離心;超速離心:差速離心法和密度梯度離心法，后者又分速率區(qū)帶離心和等密度離心。二、離心方法的選用1、差速離心采用不同離心速度與時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離；已破碎的細(xì)胞沉淀（細(xì)胞核）上清液沉淀（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體）上清液沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶性組分）500g,10’10000g,10’100000g,3h2、密度梯度離心又稱(chēng)速率—區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法；原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；可用來(lái)分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成分密度升高3、等密度離心原理：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離；區(qū)別:離心介質(zhì)、密度梯度范圍與密度梯度離心不同，欲分離的顆粒密度處于離心介質(zhì)密度范圍內(nèi)。介質(zhì)有：氯化銫、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等。操作：介質(zhì)溶液與樣品液混合均勻，足夠時(shí)間離心。介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過(guò)離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。常用來(lái)分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。密度梯度低速離心用rpm表示，高速、超高速離心用相對(duì)離心力（RCF）表示。三、離心條件的確定1、離心力離心力離心加速度相對(duì)離心力（RCF）2、離心時(shí)間不同離心方法，離心時(shí)間的概念不同。對(duì)常數(shù)離心、高速離心、差速離心,指顆粒完全沉降到離心管底的時(shí)間,沉降時(shí)間或澄清時(shí)間;等密度梯度離心,指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)時(shí)平衡時(shí)間，平衡時(shí)間;對(duì)密度梯度,指形成界限分明區(qū)帶的時(shí)間，區(qū)帶形成時(shí)間;沉降時(shí)間沉降系數(shù)已知顆粒效率因子KS：沉降系數(shù)；ω:角速度；r1，r2:轉(zhuǎn)軸中心到液面與管底距離。K與轉(zhuǎn)子半徑和轉(zhuǎn)速有關(guān)；實(shí)際操作中：1，某一顆粒S定值，故K小，t也小，效率高（轉(zhuǎn)子的選擇）；2,轉(zhuǎn)子與離心機(jī)確定，具體顆粒而言，ω2t是常數(shù)，故可調(diào)整ω與t得相同效果。指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時(shí)間;決定于沉降速度和沉降距離。一般為4oC。穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；超高速離心需冷凍。pH值應(yīng)處于酶穩(wěn)定的pH范圍。3、溫度和pH值第五節(jié)過(guò)濾與膜分離過(guò)濾

借助過(guò)濾介質(zhì)將大小不同，形狀不同的物質(zhì)分離的技術(shù)介質(zhì)有濾紙、纖維、陶瓷、高分子膜等。以膜為過(guò)濾介質(zhì)的過(guò)濾稱(chēng)膜分離技術(shù)；微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都屬于膜分離技術(shù)表4-4過(guò)濾的分類(lèi)與特性（P112）類(lèi)別

截留的顆粒大小主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2um酵母、霉菌、動(dòng)植物細(xì)胞、固形物濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷微濾0.2~2um細(xì)菌、灰塵微濾膜超濾20A~0.2um病毒、生物大分子超濾膜反滲透<20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜一、非膜過(guò)濾截留顆粒直徑大于2μm,用于分離酵母、霉菌、動(dòng)植物細(xì)胞、培養(yǎng)基殘?jiān)?。過(guò)濾介質(zhì)有濾紙、濾布、多孔陶瓷等。(1)常壓過(guò)濾以液位差為推動(dòng)力，易操作，分離效果差，難成規(guī)模。(2)加壓過(guò)濾以壓力泵或壓縮空氣為推動(dòng)力。效果較好，生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。(3)減壓過(guò)濾真空過(guò)濾、抽濾。多用于粘性不大的物料。1、粗濾2、微濾微孔過(guò)濾,截留顆粒直徑0.2～2μm，光學(xué)顯微鏡可見(jiàn)顆粒，采用微孔陶瓷、微濾膜等。二、膜分離技術(shù)借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿臃蛛x的技術(shù)。薄膜有丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力；根據(jù)截留的顆粒大小可分為3種；MEF微