酶工程概述課件

第七章酶工程基本原理第一節(jié)酶工程概述第二節(jié)酶工程基本技術(shù)及應(yīng)用實例第一節(jié)酶工程概述一、酶工程二、酶的分類及命名三、酶的特點與活性四、酶的生產(chǎn)方法Theengineeringofenzymesaysall－C－OHOH－NH－－C－NH－O-H2O一、酶工程1.什么是酶酶（enzyme）是生物體內(nèi)活細(xì)胞所產(chǎn)生的一種具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)(少數(shù)為RNA)或其復(fù)合體，是生物催化劑。

例如：由胰腺分泌的胰蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶），它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。NH－(CH2)4－CH－COOH

NH2…－(CH2)4－CH－C－OOHONHNHHNONHNH精氨酸殘基賴氨酸殘基…二、酶的分類與命名國際生物化學(xué)聯(lián)合會酶學(xué)委員會（enzymecommission，EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，將酶分為6大類。即：1.酶的分類氧化還原酶類（oxido-reductases）轉(zhuǎn)移酶類（transferases）水解酶類（hydrolases）裂解酶類（lyases）異構(gòu)酶類（isomerases）合成酶類（synthetases）⑴氧化還原酶類

氧化還原酶類用于催化氧化還原反應(yīng)。生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)多以脫氫、加氫的方式進(jìn)行。脫氫為氧化，加氫為還原。氧化還原酶類是生物獲取能量的一種重要酶。例如：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下氧化成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶│CH2OH(CHOH)4│CHO│COOH(CHOH)4│CHO+O2+H2O又如：細(xì)胞內(nèi)乙醇在乙醇脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)化為乙醛，使乙醇脫氫酶的輔酶NAD還原為NDAH2。CH3CH2－OH乙醇脫氫酶CH3－C－HONADNADH2⑵轉(zhuǎn)移酶類

轉(zhuǎn)移酶類用于催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。轉(zhuǎn)移酶類是生物代謝及能量轉(zhuǎn)移的一種重要酶。例如：氨基酸的代謝。谷丙轉(zhuǎn)氨酶COOH(CH2)2HCNH2+C＝O+CHO己糖激酶ATPADP又如：葡萄糖在己糖激酶的催化下，被活化為6-磷酸葡萄糖，使底物分子上的高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP分子上。COOHCH3COOH谷氨酸丙酮酸COOH(CH2)2HCNH2C＝OCOOHCH3COOHα-酮戊二酸丙氨酸CH2OH+CO2(CHOH)4CHOCH2OP(CHOH)4⑷裂解酶類

裂解酶類用于催化底物發(fā)生非水解性、非氧化性分解反應(yīng)。這類反應(yīng)在生物體代謝中起著重要作用，其特點是通過反應(yīng)分離出H2O、NH3、CO2及醛等小分子，使底物留下雙鍵；或反過來催化底物的雙鍵加成反應(yīng)。天冬氨酸酶例如：天冬氨酸的裂解HOOC-CHNH2HOOC-CH2HOOC-CHHOOC-CH+NH3又如，溶菌酶是一種能裂解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。6－磷酸葡萄糖異構(gòu)酶⑸異構(gòu)酶類

異構(gòu)酶類用于催化底物發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)，包括旋光（或立體）異構(gòu)、順反異構(gòu)、分子內(nèi)氧化還原及分子內(nèi)轉(zhuǎn)移等。例如：葡萄糖異構(gòu)反應(yīng)生成果糖OOHOHOHHOCH2OHOOHOHOHHOCH2OH葡萄糖異構(gòu)酶CHOH－C－OHHO－C－HH－C－OHH－C－OHCH2OPO32-CHOC＝OHO－C－HH－C－OHH－C－OHCH2OPO32-⑹合成酶類

合成酶又稱為連接酶(ligases)，常用于催化使兩個底物連接成一個分子。此類反應(yīng)在生物體內(nèi)關(guān)聯(lián)著許多重要生命物質(zhì)（如：蛋白質(zhì)、脂肪）的合成。例如：丙酮酸羧化酶利用ATP分解釋放的能量催化丙酮酸與CO2合成草酰乙酸COOH丙酮酸羧化酶C＝OCH3+CO2ATPADPCH2-COOHCOOHC＝O例如：催化下述反應(yīng)的乳酸脫氫酶系統(tǒng)名稱L-乳酸：NAD氧化還原酶分類編號EC1.1.1.27+NAD+NADH2乳酸脫氫酶OOHOHOOOHL-乳酸丙酮酸⑵習(xí)慣命名

習(xí)慣命名通常也是根據(jù)底物名稱及反應(yīng)類型進(jìn)行命名，但沒有系統(tǒng)命名法嚴(yán)格、詳細(xì)。例如，上述催化L-乳酸脫氫的酶——乳酸脫氫酶。三、酶的特點與活性1.酶的催化特點

酶作為一種特殊的催化劑，除了與一般催化劑共同具有：“反應(yīng)前后其量化學(xué)性質(zhì)不發(fā)生改變”、“改變反應(yīng)速度”、“不改變化學(xué)反應(yīng)平衡點”外，還具有如下幾個方面的特點。

酶的催化效率非常高，是其它無機(jī)（或有機(jī)）催化劑的106-1013倍。例如：雙氧水的催化分解反應(yīng)⑴催化效率高2H2O22H2O+O2催化劑用Fe2+做催化劑催化效率為：6×10-4mol/(mol·s)用過氧化氫酶催化催化效率為：6×106mol/(mol·s)問題：什么是催化劑？⑵高度的專一性

酶的專一性是指酶對其作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種酶只能催化某一類，甚至某一種物質(zhì)起化學(xué)變化。根據(jù)酶的專一性情況，我們可將其分為三類。即：H2N-CO-NH2+H2O2NH3+CO2脲酶①絕對專一性

一種酶只能催化一種底物使其發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)。例如，脲酶只能催化尿素水解。②相對專一性

一種酶只對具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的底物都能進(jìn)行某種類型的催化反應(yīng)。例如，酯酶催化酯鍵的水解。③立體專一性

一種酶只對具有某種立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物進(jìn)行某種類型的催化反應(yīng)。例如，L-乳酸脫氫酶只能催化L-乳酸氧化，對D-乳酸不起作用。2.酶的催化活性蛋白質(zhì)按其組成可分為單純蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)兩大類。單純蛋白質(zhì)完全水解后，得到的最終產(chǎn)物是氨基酸；結(jié)合蛋白質(zhì)是由單純蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組成，非蛋白質(zhì)部分稱之為輔基。例如：核蛋白（含核酸）、糖蛋白（含多糖）、脂蛋白（含脂類）、磷蛋白（含磷酸）、金屬蛋白（含金屬）等。酶同樣也可分為單純酶和結(jié)合酶兩大類。單純酶是由單純蛋白質(zhì)組成的酶，其催化活性僅由其酶蛋白部分決定；而結(jié)合酶是由單純蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組成，其催化活性除酶蛋白部分外，還需要金屬離子或其它小分子有機(jī)化合物作為酶的輔助因子。⑴酶的組成全酶＝酶蛋白＋輔助因子（結(jié)合酶）（輔酶、輔基、金屬離子）在全酶中，酶蛋白和輔助因子分別單獨存在時，均無催化活力，只有當(dāng)兩者結(jié)合成全酶時，才能表現(xiàn)出催化活力。酶的輔助因子包括輔酶和輔基。①輔酶輔酶是一類可以將化學(xué)基團(tuán)從一個酶轉(zhuǎn)移到另一個酶上的“有機(jī)小分子”，與酶蛋白的結(jié)合較為松散，可用透析法將輔酶透析出來。例如：維生素B1、維生素B2等。H3CNNNH2NSCH2CH2OHCH3+Cl-NNNOH3CH3CNHOHOOHOHHO什么是透析？資料卡片1.透析（dialysis）所謂透析是指：利用小分子通過半透膜擴(kuò)散的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。半透膜半透膜是一種只給某種分子或離子擴(kuò)散進(jìn)出的薄膜，對不同質(zhì)點的通過具有一定的選擇性的薄膜。2.半透膜（semipermeablemembrane）

酶屬生物大分子，相對分子質(zhì)量至少在1萬以上，大的可達(dá)到幾百萬，比底物的分子質(zhì)量大得多。實驗證明，酶的活性并不與整個分子的各個部分有關(guān)，其活力表現(xiàn)只是集中在某一區(qū)域。例如。脲酶的相對分子質(zhì)量為48萬。但只須用4個Ag+與之結(jié)合，其活性則徹底散失。⑵酶的催化活性中心

因為組成酶活性中心的氨基酸殘基的側(cè)鏈存在著各種不同的功能基團(tuán)，如：-NH2、-COOH、-SH、-OH和咪唑基等，它們來自酶分子多肽鏈的不同部位。這些基團(tuán)有些與底物結(jié)合時，起結(jié)合基團(tuán)的作用，有的在催化反應(yīng)中起催化基團(tuán)的作用，有的既在結(jié)合中起作用，又在催化中起作用。所以常將活性部位的功能基團(tuán)統(tǒng)稱為必需基團(tuán)。

實驗證明，在一定的溫度和pH條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度時，酶的濃度與反應(yīng)速度呈正比關(guān)系；當(dāng)酶濃度很高時，曲線逐漸趨向平緩。⑴酶的濃度012345V(酶促進(jìn)反應(yīng)初速度)246810[E](酶濃度)3.影響酶活性的因素E+SESE+P酶底物中間產(chǎn)物酶產(chǎn)物

酶促反應(yīng)速度受酶濃度和底物濃度的影響，也受溫度、pH、激活劑和抑制劑的影響。

米契里斯（Michaelis）和門坦（Menten）根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)出酶促反應(yīng)速度方程式，即米-門公式。

⑵底物濃度——米－門公式V=Vmax[S]Km+[S]式中：

V為酶促進(jìn)反應(yīng)初速度；Vmax為達(dá)到極限的最大速度；[S]為底物反應(yīng)濃度；Km為酶特征性常數(shù)。

對于一個給定的酶催化反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]較低時，酶促進(jìn)反應(yīng)速度

V

隨著底物濃度的增大(急驟)增大。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^1/2Vmax后，酶促進(jìn)反應(yīng)速度增幅逐步減小；當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢ㄖ岛?，酶促進(jìn)反應(yīng)速度不再與底物濃度有關(guān)。[S]VVmaxKm?Vmax⑷pH值

酶反應(yīng)介質(zhì)的pH值會影響酶分子，特別是活性中心上必需基團(tuán)的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，也可影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合。只有在特定的pH條件下，酶、底物和輔酶的解離情況，最適宜于它們互相結(jié)合，并發(fā)生催化作用，使酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值，這種pH值稱為酶的最適pH(optimumpH)。

注意：最適pH和酶的最穩(wěn)定pH不一定相同，和體內(nèi)環(huán)境的pH也未必相同。⑸抑制劑

凡是能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)，稱做酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素（如：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等），不屬于抑制劑。通常根據(jù)抑制劑的抑制作用，可將其分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。

不可逆性抑制作用，通常是抑制劑與酶以共價鍵方式結(jié)合，是抑制劑與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合，使酶喪失活性?！静豢赡嬉种苿?/p>

可逆性抑制作用，通常是抑制劑與酶以非共價鍵結(jié)合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的?！究赡嬉种苿抠Y料卡片胰酶提取工藝流程凍胰臟(材料)破碎勻漿活化5-10℃24-36h活化胰漿材料預(yù)處理分離提取提取粗濾pH5-610-20℃25%C2H5OH胰乳沉淀物沉淀離心分離95%C2H5OH0-5℃脫脂上清液乙醚干燥產(chǎn)品(胰酶原粉)濃縮純化資料卡片菠蘿蛋白酶提取工藝流程菠蘿皮(材料)壓榨汁液濃縮純化材料預(yù)處理吸附物吸附吸附劑上清液提取分離洗脫、壓濾鹽析洗脫液硫酸銨離心分離溶解沉淀物粗酶水pH7-7.5過濾濾液沉淀鹽酸pH4.0離心分離沉淀物冷凍干燥精制產(chǎn)品(菠蘿蛋白酶)2.化學(xué)合成法化學(xué)合成法是運(yùn)用各種儀器設(shè)備，通過化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行人工合成而獲得所需的酶的生產(chǎn)過程。自1969年，美國科學(xué)家首次采用化學(xué)合成的方法獲得了含有124個氨基酸的核糖核酸酶后，化學(xué)合成法初步成為一種生產(chǎn)酶的技術(shù)。化學(xué)合成法要求技術(shù)條件和經(jīng)濟(jì)條件高，并且只能合成那些已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。所以，化學(xué)合成法目前仍然停留在實驗室內(nèi)合成的階段。但是，隨著人們對酶生物合成、結(jié)構(gòu)及其生物催化機(jī)理的進(jìn)一步深入了解，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，化學(xué)合成法同樣將是酶工程制藥的一個重要組成部分。

酶作為生物催化劑普遍存在與動物、植物、微生物生物體中。最早人們多從動物臟器、腺體及植物果實、種子中提取酶。自19世紀(jì)末，日本人用曲霉通過固體培養(yǎng)生產(chǎn)“他卡”淀粉酶用作消化劑開始，利用微生物進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)酶就逐步發(fā)展起來。20世紀(jì)20年代，德國人用枯草桿菌生產(chǎn)α－淀粉酶，用于棉布退漿技術(shù)，使微生物酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)40年代，日本人用深層發(fā)酵法生產(chǎn)α－淀粉酶，可視為微生物生產(chǎn)酶的大規(guī)模工業(yè)化的開始。目前，工業(yè)上應(yīng)用的酶，大多采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。3.發(fā)酵法問題：發(fā)酵法生產(chǎn)酶的基本工序有哪些？資料卡片一、真菌α—淀粉酶的提取工藝流程菌株誘變選育米曲霉2197種子擴(kuò)大培養(yǎng)菌種發(fā)酵發(fā)酵液發(fā)酵的上游工程發(fā)酵的中游工程（材料）過濾浸提壓濾稀酶液超濾濃縮液乙醇沉析沉析液過濾濾液熱處理70－90℃噴霧干燥產(chǎn)品(真菌α—淀粉酶)酶泥沉淀物濾渣預(yù)處理提取分離濃縮純化資料卡片二、淀粉酶

淀粉酶是水解淀粉、糖原酶類的總稱，屬糖苷酶類。根據(jù)水解淀粉的方式不同，淀粉酶可分為α－淀粉酶、β－淀粉酶、糖化酶及異淀粉酶4類。1.α－淀粉酶

α－淀粉酶是一種內(nèi)切酶，從淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)切割α－1，4糖苷鍵，使淀粉降解成小分子糊精、麥芽糖。

α－淀粉酶是由枯草桿菌、米曲霉等制成，主要用于淀粉糊化（如葡萄糖、酒精生產(chǎn)）和織物退漿等。OHHCH2OHOOHHOHHHOHOHHCH2OHOOHHOHHOHH123456HCH2OHOOHHOHHHHOHCH2OHOOHHOHHO……Oα－1，4糖苷鍵資