抗生素備課發(fā)酵過程的控制

抗生素備課發(fā)酵過程的控制第1頁/共80頁第一節(jié)發(fā)酵過程主要控制參數(shù)與微生物發(fā)酵有關(guān)的參數(shù)，可分為物理、化學和生物三類。一、物理參數(shù)1、溫度（℃）2、壓力（Pa）3、攪拌轉(zhuǎn)速（r/min）4、攪拌功率（kV）5、空氣流量[V/（V?min），簡稱VVM]6、黏度第2頁/共80頁二、化學參數(shù)1、pH值2、基質(zhì)濃度指發(fā)酵液中糖、N、P等重要營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。3、溶解氧濃度4、產(chǎn)物濃度第3頁/共80頁三、生物參數(shù)1、菌絲形態(tài)一般都以菌絲形態(tài)作為衡量種子質(zhì)量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。2、菌體濃度第4頁/共80頁參數(shù)檢測傳統(tǒng)的檢測在線測量：。抗生素發(fā)酵過程中在線測量有許多優(yōu)點，如及時、省力，且可從煩瑣操作中解脫出來，便于計算機控制。但其應(yīng)用的困難在于發(fā)酵液的性質(zhì)復雜，一般培養(yǎng)液中同時存在三相，即液、氣、固體不溶物或油。第5頁/共80頁第二節(jié)發(fā)酵過程中的代謝變化微生物培養(yǎng)有：分批培養(yǎng)、分批補料培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)三種方式。工業(yè)上大都采用分批培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)，特別是分批補料培養(yǎng)。1、分批培養(yǎng)：指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)含有初始限制量的基質(zhì)的發(fā)酵方式。第6頁/共80頁發(fā)酵過程的三個時期：1231.停滯期2.對數(shù)期3.穩(wěn)定期時間細胞數(shù)目的對數(shù)第7頁/共80頁1）停滯期在剛開始接種后的一段時間，幾乎未見菌體濃度的增加。工業(yè)上要求盡可能縮短延滯期，這可通過使用適當種齡的種子和接種量達到。2）對數(shù)生長期微生物在此期內(nèi)的比生長速率最大，細胞數(shù)目呈指數(shù)生長。3）穩(wěn)定期由于養(yǎng)分的消耗和微生物產(chǎn)物的分泌，生長速率逐漸減速直至停止。生長終止原因可能是由于某些必須養(yǎng)分的耗盡和自體毒性代謝物在培養(yǎng)基上積累的結(jié)果。在穩(wěn)定期，許多次級代謝產(chǎn)物在此期合成，因此也稱為生產(chǎn)期。第8頁/共80頁2、補料分批發(fā)酵（Fed-batchculture，F(xiàn)BC）指在分批培養(yǎng)過程中，間隙或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。3、連續(xù)發(fā)酵也稱連續(xù)流加培養(yǎng)，即培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液。由于營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)與消耗相平衡，培養(yǎng)系統(tǒng)成為穩(wěn)定的狀態(tài)。第9頁/共80頁連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)點：能維持低基質(zhì)濃度，可以提高設(shè)備的利用率和單位時間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時間，便于自動控制。但由于培養(yǎng)時間長，難以保證純種培養(yǎng)。并且菌種變異可能性較大，故在工業(yè)規(guī)模上很少采用。第10頁/共80頁第三節(jié)基質(zhì)的影響及其控制基質(zhì)：培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)?；|(zhì)是產(chǎn)生菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，既涉及菌體的生長繁殖，又涉及代謝產(chǎn)物的形成。一、C源種類和濃度的影響及控制迅速利用碳源：緩慢利用碳源：第11頁/共80頁

碳源濃度的控制:

采用中間補料的方法控制，包括補糖時間、補糖量和補糖方式。第12頁/共80頁二、N源種類和濃度的影響及控制N源：有機N源、無機N源

迅速利用N源：緩慢利用N源：如黃豆餅粉、花生餅粉、棉子餅粉等，對延長抗生素的分泌期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量有好處。發(fā)酵培養(yǎng)基一般是選用快速和慢速利用的混合源。第13頁/共80頁

為了調(diào)節(jié)菌體生長和防止菌體衰老自溶，除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的N源外，還要在發(fā)酵過程中補加N源來控制濃度。生產(chǎn)中采用的方法有：1、補加有機N源根據(jù)產(chǎn)生菌的代謝情況，可在發(fā)酵過程中添加酵母粉、玉米漿、尿素等。2、補加無機N源補加氨水或硫酸銨是工業(yè)上的常用方法。氨水既可作為無機N源，又可調(diào)節(jié)pH。第14頁/共80頁三、磷酸鹽濃度的影響和控制微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32~300mmol,但對抗生素合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol,提高到10mmol,就明顯地抑制其合成。磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適當?shù)臐舛取股匕l(fā)酵來說，常常采用生長亞適量（對菌體生長不是最適合但又不影響產(chǎn)物合成的量）的磷酸鹽濃度。第15頁/共80頁第五節(jié)溫度的影響極其控制一、溫度對發(fā)酵的影響溫度的變化對發(fā)酵可產(chǎn)生兩方面的影響：一方面是影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)；另一方面是影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。第16頁/共80頁

另外，溫度有時也會影響菌體代謝產(chǎn)物合成的方向。金色鏈霉菌進行四環(huán)素發(fā)酵中，隨著發(fā)酵溫度的提高，有利于四環(huán)素的合成，30℃以下時合成的金霉素增多，達35℃時就只產(chǎn)四環(huán)素，而金霉素合成幾乎停止。溫度對發(fā)酵液的黏度、基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率、某些基質(zhì)的分解和吸收速率等，都受溫度變化的影響，進而影響發(fā)酵動力學特性和產(chǎn)物的合成。第17頁/共80頁二、影響發(fā)酵溫度變化的因素Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌–Q蒸發(fā)–Q顯–Q輻射第18頁/共80頁三、溫度的控制1、最適溫度的選擇作為次級代謝產(chǎn)物的抗生素,微生物發(fā)酵其最適菌體生長溫度和最適抗生素合成溫度往往存在差異。如在2%乳糖、2%玉米漿和無機鹽的培養(yǎng)基中對青霉素產(chǎn)生菌進行發(fā)酵研究，測得菌體的最適生長溫度為30℃，而青霉素合成的最適溫度又為24.7℃。第19頁/共80頁又如在林可霉素發(fā)酵的不同階段采用不同的培養(yǎng)溫度，對生產(chǎn)菌菌絲形態(tài)和發(fā)酵單位產(chǎn)生影響。培養(yǎng)起初60ｈ維持在31℃,隨后降到30℃培養(yǎng)70ｈ,再回升至31℃培養(yǎng)至放罐,結(jié)果顯示:生產(chǎn)菌中、后期菌體濃度下降幅度減小,菌絲上的空泡縮小,自溶期推遲,發(fā)酵單位得到了提高。因此發(fā)酵溫度的確定，在理論上，整個發(fā)酵過程中不應(yīng)只選一個培養(yǎng)溫度，而應(yīng)根據(jù)不同的階段，選擇不同的溫度。在生長階段，應(yīng)選擇最適生長溫度，在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。

第20頁/共80頁最適發(fā)酵溫度還隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段而改變。如，在較差的通氣條件下，由于氧的溶解度是隨溫度下降而升高，因此降低發(fā)酵溫度對發(fā)酵是有利的，因為低溫可以提高氧的溶解度、降低菌體生長速率，減少氧的消耗，從而可彌補通氣條件差所帶來的不足。2、溫度的控制由于發(fā)酵過程中釋放大量發(fā)酵熱，需要冷卻情況較多。一般情況下，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇形管中，進行熱交換降溫。如果氣溫較高，冷卻水的溫度又高，可采用冷凍鹽水進行循環(huán)式降溫。第21頁/共80頁第六節(jié)pH的影響極其控制一、微生物細胞生長和代謝產(chǎn)物形成的最適pH值不同微生物對pH值的要求不同，大多數(shù)細菌的最適pH值為6.5-7.5,霉菌的最適pH值為4.0-8.0,酵母菌的最適pH值為3.8-6.0,放線菌的最適pH值為6.5-8.0。pH值不僅影響微生物的生長，還會影響到代謝產(chǎn)物的形成。第22頁/共80頁并且微生物生長的最適pH值和發(fā)酵產(chǎn)物形成的最適pH值往往不同。如青霉素產(chǎn)生菌生長的最適pH值為6.5-7.2,而青霉素合成的最適pH值為6.2-6.3。鏈霉素產(chǎn)生菌生長的最適pH值為6.3-6.9,而青霉素合成的最適pH值為6.7-7.3。二、pH對微生物生長繁殖和產(chǎn)物的形成的影響原因第23頁/共80頁三、發(fā)酵過程中pH值的變化情況發(fā)酵過程中由于微生物細胞在一定的溫度及通氣條件下，隨著微生物對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的利用及某些物質(zhì)的積累，發(fā)酵液的pH值會發(fā)生一定的變化。1、在微生物細胞的生長階段，相對于接種后的起始pH值來說，發(fā)酵液的pH值有上升或下降的趨勢。第24頁/共80頁2、在生產(chǎn)階段，一般發(fā)酵液的pH值趨于穩(wěn)定，維持在最適產(chǎn)物形成的pH范圍。3、在微生物細胞的自溶階段，隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，微生物細胞內(nèi)蛋白酶積累和活躍，微生物趨于自溶，引起培養(yǎng)液中的氨基氮等的增加，致使pH上升。引起發(fā)酵液pH值下降的主要原因有：1）培養(yǎng)基中C/N比例不當，C源過多，如葡萄糖過量或中間補糖過多或溶解氧不足，使糖的氧化不完全，培養(yǎng)液有機酸大量積累，使pH值下降；2）消泡油加得過多；3）生理酸性物質(zhì)的存在，使pH值下降。第25頁/共80頁引起發(fā)酵液pH值上升的主要原因有：1）培養(yǎng)基中C/N比例不當，氮源過多，氨基氮釋放會使pH值上升；2）生理堿性物質(zhì)的存在；3）中間補料液中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過多。四、發(fā)酵過程中pH的控制1、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH值，或加入緩沖溶液制成緩沖能力強、pH值變化不大的培養(yǎng)基，或使鹽類和碳源的配比平衡。2、可在發(fā)酵過程中加入弱酸或弱堿進行pH值的調(diào)節(jié)，進而合理地控制發(fā)酵條件。3、如果僅用酸或堿調(diào)節(jié)pH值不能改善發(fā)酵情況時，進行補料是一個較好的辦法，既調(diào)節(jié)第26頁/共80頁了pH值，又可補充營養(yǎng)，也進一步提高發(fā)酵產(chǎn)率。通過補料調(diào)節(jié)pH值來提高發(fā)酵產(chǎn)率的方法已在工業(yè)發(fā)酵過程中取得了明顯的效果。4、生理酸性銨鹽作為氮源時，引起pH下降，可在培養(yǎng)液中加入CaCO3來調(diào)節(jié)pH值。但需要注意的是，CaCO3的加入量一般都很大，在操作上容易引起染菌。因此，此方法在發(fā)酵過程中應(yīng)用不是太廣。5、在發(fā)酵過程中根據(jù)pH值的變化可用流加氨水的方法來調(diào)節(jié)，同時又把氨水作為氮源供給。由于氨水作用快，對發(fā)酵液的pH值波動影響大，應(yīng)采用少量多次的流加方法進行流加，以免造成p H值過高，抑制微生物的生長。 第27頁/共80頁6、以尿素作為氮源進行流加調(diào)節(jié)pH值。尿素流加引起的pH值變化有一定的規(guī)律性，易于操作控制。第28頁/共80頁

第七節(jié)溶氧的影響及其控制在抗生素生產(chǎn)的有氧發(fā)酵中,保證足量的溶解氧濃度是發(fā)酵控制的主要因素之一。氧在水中的溶解度很小，在25℃和1×105Pa時，空氣中的氧在水中溶解度僅0.25mol/m3左右,能維持微生物菌體15~20s的正常呼吸，隨之就會耗盡。在實驗室中，通過搖瓶機的往復運動對搖瓶中的微生物供養(yǎng)，而中間實驗規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模的培養(yǎng)裝置則需采用通入無菌空氣并同時進行攪拌的方式對微生物供養(yǎng)。第29頁/共80頁通氣和攪拌的目的就是提供微生物生長和代謝所需的氧，并使微生物在培養(yǎng)液中處于懸浮狀態(tài)以及提高代謝產(chǎn)物的傳遞速度。一、發(fā)酵過程溶解氧濃度的變化對多數(shù)發(fā)酵來說，氧的不足會造成代謝異常，產(chǎn)量降低。溶解氧最易變?yōu)榘l(fā)酵中的主要矛盾。只有了解發(fā)酵過程中溶解氧濃度的變化，才能有效地控制發(fā)酵的進行。第30頁/共80頁如金霉素發(fā)酵，在生長期中短時間停止通氣，就可能影響菌體在生產(chǎn)期的糖代謝途徑，由磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)向糖酵解途徑，使金霉素合成的產(chǎn)量減少。1、臨界氧濃度臨界溶氧濃度：當培養(yǎng)基中不存在其他限制性基質(zhì)時，不影響好氧性微生物生長繁殖的最低溶解氧濃度稱為臨界氧濃度。第31頁/共80頁而微生物發(fā)酵的最適氧濃度與臨界氧濃度是不同的。最適氧濃度：溶解氧濃度對生長或產(chǎn)物合成的最適的濃度范圍。為了避免發(fā)酵處于限氧條件下，需要考查每一種發(fā)酵產(chǎn)物的臨界氧濃度和最適氧濃度，并使發(fā)酵保持在最適氧濃度范圍。這樣便可減少批次之間的波動和更有效地利用空氣動力。需氧發(fā)酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧較高雖然有利菌體的生長和產(chǎn)物的合成，但當溶氧水平太大,有時會抑制產(chǎn)物的形成。第32頁/共80頁2、溶解氧濃度的變化規(guī)律在設(shè)備和工藝條件不變的情況下，發(fā)酵過程中溶解氧的變化有一定的規(guī)律。1）在發(fā)酵前期：由于產(chǎn)生菌大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，此時需氧超過供養(yǎng)，溶氧明顯下降，溶氧曲線出現(xiàn)一個低谷。2）過了生長階段，一般需氧量略有減少，溶氧隨之上升，次級代謝產(chǎn)物開始形成。發(fā)酵中后期，溶氧濃度明顯受工藝控制手段的也許，如補料的數(shù)量、時機和方式等。如，在補糖后，菌體的需氧量增加，引起溶氧下第33頁/共80頁降，其下降幅度與菌齡、補糖量及補糖前的溶氧濃度都有關(guān)系。如工藝控制不合適，不斷地大量補糖，會使溶氧濃度低于臨界氧濃度，此時溶解氧就會成為生產(chǎn)的限制因素。3）在發(fā)酵后期，由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會明顯地上升。3、發(fā)酵異常時的溶氧變化發(fā)酵過程中若有染菌、污染噬菌體、菌體代謝異常、加油器失靈等異常情況出現(xiàn)，都可能引起溶氧濃度的異常變化。第34頁/共80頁1）發(fā)酵液中污染好氣性雜菌，溶氧濃度會在短時間內(nèi)跌到零值附近，且長時間不能回升，這比用無菌試驗來反映雜菌情況要快4~8h。2）但不是一染菌溶氧就會有大幅度的下跌，要看所染雜菌的種類和數(shù)量，還要看雜菌和產(chǎn)生菌誰占優(yōu)勢。有時染菌也會出現(xiàn)溶氧反而升高的現(xiàn)象，這是因為生產(chǎn)菌受到雜菌抑制，而雜菌本身又非十分好氣。這樣生產(chǎn)菌的呼吸大為減弱而使溶氧上升。這種情況在污染噬菌體的發(fā)酵液中更為靈敏，更早地發(fā)出預報。3）補料或加油在供氧不良的罐內(nèi)也會引起溶氧迅速降低,若溶氧原來就較低就容易降至零。一般1~3h溶氧回升，這可與染菌時的溶氧變化相區(qū)別。4）某些設(shè)備故障也會引起溶氧的變化。例如自動加油器失靈，大量漏油，會引起溶氧迅速下降。第35頁/共80頁二、溶解氧濃度的控制要控制發(fā)酵液中的溶氧濃度，從供養(yǎng)與需氧兩方面著手。影響氧傳遞系數(shù)的一些因素1、攪拌第36頁/共80頁

它能從以下幾個方面改善溶氧速率：1）攪拌能把大的空氣泡打碎成為微小氣泡，增加了氧與液體的接觸面積，而且小氣泡的上升速度要比大氣泡的慢，相應(yīng)地氧與液體的接觸時間也就增長；2）攪拌使液體作渦流運動，使氣泡不是直線上升而是作螺旋運動上升，延長了氣泡的運動路線，增加了氣液的接觸時間；3）攪拌使發(fā)酵液呈湍流運動，從而減少氣泡周圍液膜的厚度，減少液膜阻力，因而增大了KLa值；4）攪拌使菌體分散，避免結(jié)團，有利于固液傳遞中的接觸面積的增加，使推動力均一，同時也減少了菌體表面液膜的厚度，有利于氧的傳遞。第37頁/共80頁2、空氣的線速度當增加通風量時，空氣的線速度也就相應(yīng)地增大，從而增加了溶氧，氧傳遞系數(shù)Kla相應(yīng)地也增大。當然過大的空氣線速度會使攪拌槳葉不能打散空氣，氣流形成大氣泡在軸的周圍逸出，使攪拌效率和溶氧速率都大大降低。3、空氣分布管空氣分布管的型式、噴口直徑及管口與罐底距離的相對位置對氧溶解速率有較打影響。第38頁/共80頁4、培養(yǎng)液的性質(zhì)在發(fā)酵過程中，由于微生物的生命活動，分解并利用培養(yǎng)液中的基質(zhì)，大量繁殖菌體，積累代謝產(chǎn)物等都引起培養(yǎng)液的性質(zhì)改變。5、表面活性劑培養(yǎng)液中消泡用的油脂等具有親水端和疏水端的表面活性物質(zhì)分布在氣液界面，增大了傳遞的阻力，使氧傳遞系數(shù)Kla降低。第39頁/共80頁需氧的控制：在一定的供氧能力下能控制需氧量，既做到滿足生產(chǎn)菌的生長和產(chǎn)物合成對氧的需要，又不超過設(shè)備的供氧能力，使生產(chǎn)菌在這一條件下發(fā)揮最大的生產(chǎn)能力?？刂妻k法：如控制補料速度、溫度的調(diào)節(jié)，中間補水，控制菌體濃度。第40頁/共80頁第八節(jié)補料的作用及其控制一、補料分批培養(yǎng)作用補料分批培養(yǎng)（FBC）對微生物發(fā)酵有下列幾個基本作用：1、可以控制抑制性底物的濃度在許多發(fā)酵過程中，微生物的生長是受到基質(zhì)濃度的影響。要想得到高密度的生物量，需要投入幾倍的基質(zhì)。再增加底物濃度，就可能發(fā)生一種基質(zhì)抑制區(qū)，遲滯期延長，比生長速率減小，菌濃下降等，所以高濃度營養(yǎng)物對大多數(shù)微生物生長是不利的。第41頁/共80頁2、可以解除或減弱分解代謝產(chǎn)物阻遏在微生物合成初級或次級代謝產(chǎn)物中，有些合成酶受到易利用碳源或氮源的阻遏，特別是葡萄糖，它能夠阻抑多種酶或產(chǎn)物的合成，如青霉素、赤霉素等。這種阻遏作用不是葡萄糖的直接作用，而是由葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物引起的。通過補料來限制基質(zhì)的濃度，就可解除酶或其代謝產(chǎn)物合成受阻，提高產(chǎn)量。3、可以使發(fā)酵過程最佳化利用FBC技術(shù)，可以使菌種保持在最大生產(chǎn)力的狀態(tài)。第42頁/共80頁二、補料分批培養(yǎng)的補料方式和控制補料方式：連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加。每次流加方式：快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加、變速流加。三、補料內(nèi)容1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基2、碳源補糖（葡萄糖）3、氮源補充有機氮源、通氨、尿素4、微量元素5、補水第43頁/共80頁四、流加補料的內(nèi)容和原則原則：控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。為此，要根據(jù)微生物的生長代謝、生物合成規(guī)律，利用流加補料的措施給予生產(chǎn)菌適當?shù)恼{(diào)節(jié)，讓它能在生物合成階段有足夠而又不過多的營養(yǎng)物質(zhì)供其維持正常代謝和合成產(chǎn)物的需要。第44頁/共80頁第九節(jié)泡沫的影響及其控制一泡沫的危害泡沫的形成：培養(yǎng)基中有蛋白質(zhì)類表面活性劑存在，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。泡沫形成的危害：1）減小發(fā)酵罐的裝料系數(shù)、氧傳遞系數(shù)；2）泡沫過多時形成大量逃液；3）增加發(fā)酵液污染機會；4）嚴重時使攪拌無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導致代謝異?；蚓w自溶。二、消除泡沫的方法1、機械消沫第45頁/共80頁

分為罐內(nèi)消沫、罐外消沫。前者靠罐內(nèi)消沫槳轉(zhuǎn)動打碎泡沫；后者將泡沫引出罐外，通過噴嘴的加速作用或離心力來消除泡沫。2、消沫劑消沫是利用外界加入消沫劑，使泡沫破裂的方法。消沫劑作用：降低泡沫液膜的機械強度，或者是降低液膜的表面黏度，或兼而有之，達到破裂泡沫的目的。常用消沫劑：天然油脂類、化學消沫劑天然油脂不僅可作為消沫劑，還可作為碳源使用，但使用效果不如化學合成的消沫劑。第46頁/共80頁化學合成消沫劑，主要指聚醚類，如聚氧丙烯甘油（GP型）、聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型）。消沫效果非常好，相當于油脂的幾十倍。第47頁/共80頁第十節(jié)發(fā)酵終點的判斷一、微生物發(fā)酵終點的判斷既要追求高生產(chǎn)力，又要顧及產(chǎn)品的成本，必須把兩者結(jié)合起來，既要有高產(chǎn)量，又要是低成本。二、確定合理放罐時間考慮因素1、經(jīng)濟因素發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)能力是實際發(fā)酵時間和發(fā)酵準備時間的綜合反應(yīng)。實際發(fā)酵時間，以最低的成本來獲得最大生產(chǎn)能力的時間為最適發(fā)酵時間。第48頁/共80頁如果發(fā)酵時生產(chǎn)速率很高，就要盡可能延長抗生素的分泌期，提高抗生素單位產(chǎn)量。但是在生產(chǎn)速率較小或停止的情況下，如果繼續(xù)延長時間，使平均生產(chǎn)能力下降，而動力消耗、管理費用支出、設(shè)備消耗等費用仍在增加，因而產(chǎn)物成本增加，就應(yīng)該即時放罐。2、產(chǎn)品質(zhì)量因素發(fā)酵時間長短對后提取工序與產(chǎn)品質(zhì)量有很大關(guān)系。如果發(fā)酵時間太短，有過多的尚未代謝的營養(yǎng)物質(zhì)殘留在發(fā)酵液中。給提取帶來不利影響。但是如果發(fā)酵時間太長，第49頁/共80頁菌體會自溶，釋放菌體蛋白或酶，發(fā)酵液變粘稠，增加過濾工序的難度，使不穩(wěn)定產(chǎn)物降解。所有這些影響，都會使抗生素產(chǎn)量下降，產(chǎn)物雜質(zhì)含量增加。3、特殊因素對老品種來說，放罐時間都已掌握，在正常情況下可根據(jù)作業(yè)計劃，按時放罐。但在異常情況下，如染菌、代謝異常，就應(yīng)根據(jù)不同情況及時處理。發(fā)酵終點的判斷，要綜合這些因素來確定。第50頁/共80頁第九章抗生素產(chǎn)生菌的

代謝調(diào)節(jié)控制第一節(jié)初級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)微生物在長期的進化過程中，經(jīng)過自然選擇，建立了有利于自身存在的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。因為微生物在自然界生存，經(jīng)常會發(fā)生這樣或那樣的變異，當變異有利于微生物存在時，就有可能保留下來；而當變異不利于微生物自身存在時，就會在自然選擇過程中被淘汰。這樣合理的變異經(jīng)過長期的積累，就形成了代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。第51頁/共80頁菌體代謝類型：分解代謝和合成代謝初級代謝和次級代謝初級代謝產(chǎn)物：指微生物生長和繁殖所必須的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等。次級代謝產(chǎn)物：指由微生物產(chǎn)生的與微生物的生長、繁殖無關(guān)的一類物質(zhì)?？股厥俏⑸锼a(chǎn)生的最大的一類次級代謝產(chǎn)物。微生物的代謝是由各種酶所催化的，因此，代謝的調(diào)節(jié)，實質(zhì)上，主要是通過控制酶的生成和功能而實現(xiàn)的。一、酶生成的調(diào)節(jié)第52頁/共80頁主要有誘導生成、終產(chǎn)物阻抑、分解代謝物阻抑三種形式。1、誘導生成酶生成的方式：1）誘導酶：只有在誘導劑存在時才生成，環(huán)境中沒有誘導劑時，酶合成就停止；2）組成酶，經(jīng)常存在于細胞內(nèi)，不隨誘導劑存在與否而轉(zhuǎn)移。如乳糖操縱子模型，乳糖作為誘導物，誘導β-半乳糖苷酶的生成。由于酶誘導生成的調(diào)節(jié)，使得微生物僅在需要時才合成某些酶，不需要時便不能生成。以避免了能量和代謝物的浪費。第53頁/共80頁2、酶生成的阻抑酶生成的阻抑：由于某種化合物的存在而阻止了酶的合成。分為終產(chǎn)物阻抑與分解代謝物阻抑1）終產(chǎn)物阻抑：起阻抑作用的化合物是某一合成途徑的終產(chǎn)物，則稱為終產(chǎn)物阻抑。由于微生物具有終產(chǎn)物阻抑的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使得微生物在已合成足夠它需要的物質(zhì)時，或有外源加入該物質(zhì)時，就停止生成其有關(guān)合成的酶類；而當該物質(zhì)缺乏時，又開始生成這些酶。這樣就節(jié)約了大量的能量和原料。第54頁/共80頁2）分解代謝物阻抑：起阻抑作用的化合物是分解代謝途徑中的產(chǎn)物，則稱為分解代謝物阻抑也被稱為葡萄糖效應(yīng)，指E.coli對各種混合碳源的利用時,發(fā)現(xiàn)葡萄糖能抑制其他糖的利用,只有當葡萄糖被利用完以后,才能利用第二種糖,因此出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象。葡萄糖效應(yīng)其實就是一種碳分解代謝調(diào)節(jié)作用。碳分解代謝調(diào)節(jié)是指被迅速利用的碳源或其分解代謝產(chǎn)物，對其他代謝中酶的調(diào)節(jié)作用。其他能被快速利用的碳源、氮源、磷源也具有類似效應(yīng)。第55頁/共80頁3、酶生成調(diào)節(jié)機制操縱子學說二、酶功能的調(diào)節(jié)酶一旦生成后，就比較穩(wěn)定地存在，繼續(xù)起作用，消耗能量，積累過多的中間產(chǎn)物。為了防止這種不必要的消耗和積累，微生物有另一套調(diào)節(jié)系統(tǒng)，既酶活性調(diào)節(jié)(細調(diào))，使得不需要的酶立即停止活動，當需要時又可立即恢復。這種調(diào)節(jié)酶功能的作用稱為反饋抑制。1、反饋抑制第56頁/共80頁幾種類型：p.981、單一終產(chǎn)物的反饋抑制2、順序反饋抑制3、合作反饋抑制4、累加反饋抑制5、同功酶二、反饋抑制的機制調(diào)節(jié)酶學說:反饋抑制的酶有兩個結(jié)合位點，一個是和酶的底物結(jié)合，稱為活性中心，另一個和終產(chǎn)物結(jié)合，稱為調(diào)節(jié)中心。當終產(chǎn)物和調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，引起酶的結(jié)構(gòu)改變，使酶的活性中心結(jié)構(gòu)也隨之改變，不能和底物結(jié)合，而失去催化活性。第57頁/共80頁第二節(jié)抗生素產(chǎn)生菌的代謝調(diào)節(jié)一、次級代謝物生物合成的特征1、大多數(shù)抗生素生物合成有一個明顯的特征:抗生素合成是在產(chǎn)生菌的生長結(jié)束之后才出現(xiàn)。因此，可將抗生素產(chǎn)生菌的生命活動過程分為兩個時期，即營養(yǎng)生長期和次級代謝產(chǎn)物形成期。抗生素的合成過程一般是在培養(yǎng)液中缺乏某種營養(yǎng)物質(zhì)，菌體的生長受到限制時被啟動。2、抗生素產(chǎn)生菌的生長期向生產(chǎn)期轉(zhuǎn)變時，在形態(tài)學和生理學上會發(fā)生一些變化。如一些產(chǎn)芽孢細菌此時會形成芽孢，真菌和放線菌會形成孢子等。菌體的生長速率、分支第58頁/共80頁狀態(tài)和球菌的大小等都是合成抗生素的重要因素。因此，有人把抗生素的合成認為是細胞分化的伴隨現(xiàn)象。3、一種微生物的不同菌株能夠產(chǎn)生多種在分子結(jié)構(gòu)上完全不同的次級代謝產(chǎn)物。如灰色鏈霉菌不僅產(chǎn)生鏈霉素，而且還可以產(chǎn)生柱晶白霉素、吲哚霉素、灰霉素和灰綠霉素等。同樣，不同種類的微生物也能夠產(chǎn)生同一種次級代謝產(chǎn)物。如能夠產(chǎn)生青霉素的微生物包括有點青霉、產(chǎn)黃青霉、土曲霉等的一些真菌和某些鏈霉菌。第59頁/共80頁4、一種微生物的次級代謝產(chǎn)物大多是一組具有相似結(jié)構(gòu)的化合物。這使工業(yè)上對抗生素的分離純化過程比初級代謝物的分離純化要困難得多。導致產(chǎn)生多組分產(chǎn)物的主要原因是由于參與抗生素生物合成的酶對底物的特異性不強。這種特異性既可受到內(nèi)部因素的控制，也可受到外部環(huán)境的影響。因此，在工業(yè)生產(chǎn)上可通過菌種選育和發(fā)酵控制來得到更多的目的產(chǎn)物。5、抗生素的生物合成過程是一種由多基因控制的代謝過程。這些基因不僅位于微生物的染色體中，也可位于染色體外的遺傳物質(zhì)中，且在第60頁/共80頁某些抗生素生物合成中起主導作用。另外，染色體外遺傳物質(zhì)可由于外界環(huán)境的影響而從細胞中丟失，從而造成抗生素生產(chǎn)的不穩(wěn)定性。二、初級代謝與次級代謝的關(guān)系初級代謝與次級代謝的關(guān)系可以從生化代謝與遺傳代謝兩個方面來分析。1、生化代謝1）首先，從菌體生化代謝來看，抗生素的生物合成是由幾種初級代謝產(chǎn)物形成的，即初級代謝途徑提供合成抗生素的前體物質(zhì)。第61頁/共80頁2）有些營養(yǎng)物質(zhì)代謝的中間體既可以用來合成初級代謝產(chǎn)物，又可以生成次級代謝產(chǎn)物，把這類物質(zhì)稱做分叉中間體。3）次級代謝途徑中所涉及的酶系，既有與初級代謝相同的酶系，又有特異性的酶系。2、遺傳代謝初級代謝和次級代謝都是受到核內(nèi)DNA控制，并且次級代謝還受到核外遺傳物質(zhì)的控制。第62頁/共80頁中間體參與合成的抗生素短鏈脂肪酸（如乙酸、丙酸、丁酸等）大環(huán)內(nèi)酯類、聚醚類抗生素異戊二烯單位甾類化合物、萜類、新生霉素氨基酸與經(jīng)修飾的氨基酸β-內(nèi)酰胺類、肽類（桿菌肽中D-苯丙氨酸）、頭孢菌素（α-氨基己二酸）芳香中間體（莽草酸途徑的中間體或終產(chǎn)物）利福霉素、放線菌素、肽類抗生素經(jīng)修飾的糖與氨基糖大環(huán)內(nèi)酯類、氨基環(huán)醇類、蒽環(huán)類抗生素等瞇基（供體一般是精氨酸）鏈霉素（鏈霉胍中兩個瞇基）甲基（供體為甲硫氨酸）紅霉素的糖、慶大霉素

第63頁/共80頁葡萄糖3-脫氧-7-磷酸-阿拉伯庚酮糖莽草酸

利福霉素分支酸預苯酸酪氨酸由芳香中間體合成的抗生素和其它次級代謝物對氨基苯甲酸芳香多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素苯丙氨酸肽類抗生素諾卡菌素鄰氨基苯甲酸色氨酸放線菌素第64頁/共80頁L-α–氨基己二酸+L-半胱氨酸δ-（α–氨基己二酰）-半胱氨酸+纈氨酸δ-（α–氨基己二酰）-半胱氨酸-纈氨酸（ACV）異青霉素N青霉素G第65頁/共80頁三、抗生素產(chǎn)生菌的主要代謝調(diào)節(jié)作用1、磷酸鹽對次級代謝物生物合成的調(diào)控磷酸鹽對許多抗生素和其他一些微生物次級代謝產(chǎn)物具有明顯的阻遏和抑制作用。這些微生物產(chǎn)物的生物合成只有在磷酸鹽濃度適當時才能進行。有關(guān)磷酸鹽對次級代謝物的合成影響機制可概括為如下一些原因：1）磷酸鹽可促進初級代謝，而初級代謝的減弱會解除對次級代謝的阻遏；2）磷酸鹽會改變糖類分解代謝途徑；第66頁/共80頁3）磷酸鹽能限制抗生素途徑誘導物的生成；4）磷酸鹽能抑制抗生素前體的形成；5）磷酸鹽抑制或阻遏抗生素合成所必須的磷酸酶；因此很顯然，磷酸鹽控制著與抗生素合成有關(guān)的途徑，但具體機制還不很清楚。受無機磷酸鹽干擾的抗生素鏈霉素：鏈霉素合成過程中至少包括三個脫磷酸步驟，這一過程對磷酸鹽濃度非常敏感，該途徑最后從雙氫鏈霉素-6-磷酸脫去磷酸的酶被無機磷酸鹽所抑制。四環(huán)素：四環(huán)素氧化酶第67頁/共80頁殺念菌素：p-氨基苯甲酸合成酶頭孢菌素：ACV合成酶、異青霉素N合成酶慶大霉素、萬古霉素、克拉維酸等2、碳源調(diào)控在許多抗生素的產(chǎn)生途徑中，酶受到碳源的調(diào)控。如大量快速利用碳源葡萄糖經(jīng)常抑制產(chǎn)物的形成，而慢速利用碳源淀粉、乳糖等經(jīng)常作為發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝物的最好碳源。培養(yǎng)基中一般包含大量快速利用碳源和遲效碳源，在速效碳源被利用完后，遲效碳源才被利用來生產(chǎn)次級代謝物。第68頁/共80頁在諾卡菌中，去乙酰氧基頭孢菌素C合成酶被葡萄糖-6-磷酸及果糖-1，6-二磷酸所抑制，從而抑制頭孢菌素產(chǎn)生。甘油醛-3-磷酸能競爭性抑制抑制ACV合成酶。3、氮源調(diào)控許多抗生素的生物合成同樣受到氮分解產(chǎn)物的影響。如，谷氨酸和苯丙氨酸能夠阻遏參與放線菌素生物合成的犬尿氨酸甲酰胺酶II的形成；半胱氨酸和甲硫氨酸能夠阻遏參與鏈霉素生物合成的甘露糖苷鏈霉素合成酶的形成；銨能阻遏參與β-內(nèi)酰胺抗生素生物合成的三肽合成酶（ACV）和脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶的形成。第69頁/共80頁抗生素干擾碳源非干擾碳源放線菌素葡萄糖、甘油半乳糖、果糖頭孢菌素葡萄糖、甘油、麥芽糖蔗糖、半乳糖金霉素葡萄糖蔗糖紅霉素葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露糖乳糖、山梨糖慶大霉素葡萄糖、木糖果糖、甘露糖、麥芽糖卡那霉素葡萄糖鏈霉素葡萄糖四環(huán)素葡萄糖第70頁/共80頁抗生素干擾氮源非干擾氮源放線菌素L-Glu、Ala、Phe，D-ValL-Ile頭孢菌素NH4+L-Asp、Arg氯霉素NH4+D-Ser、L-Pro等紅霉素NH4+柱晶白霉素NH4+尿酸利福霉素NH4+硝酸鹽螺旋霉素NH4+鏈霉素NH4+Pro四環(huán)素NH4+殺念菌素L-Trp、Tyr第71頁/共80頁4、反饋調(diào)節(jié)支路產(chǎn)物的反饋抑制：已知微生物代謝中產(chǎn)生的一些分叉中間體，既可用來合成初級代謝產(chǎn)物，又可合成次級代謝物。在某些情況下，初級代謝的末端產(chǎn)物能反饋抑制共用途徑中某些酶的活性，從而影響次級代謝產(chǎn)物的合成。（圖p.10