放射免疫分析技術(shù)

放射免疫分析技術(shù)第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五核醫(yī)學(xué)治療：腫瘤、甲亢等診斷體內(nèi)——PET、SPECT、放射免疫成像等體外——放射免疫分析（RIA）第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)記免疫分析技術(shù)用標(biāo)記示蹤技術(shù)觀察抗原抗體一級反應(yīng)的分析方法特點(diǎn)：敏感性高，反應(yīng)時間短，可用儀器檢測結(jié)果三大標(biāo)記免疫分析技術(shù)：放射免疫、熒光免疫、酶免疫檢測方法檢測范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五一、放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA）女科學(xué)家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎1.基本原理（1）競爭結(jié)合分析：Ag+AbAgAb

*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標(biāo)記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年3.測量儀器（1）γ計(jì)數(shù)儀（2）β液閃儀第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五4.基本試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品a.

意義：放射免疫定量分析的尺度、質(zhì)量控制的依據(jù)b.

要求：化學(xué)結(jié)構(gòu)上——與待測物有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)純度上——對競爭反應(yīng)有干擾的雜質(zhì)的含量低含量準(zhǔn)確注意不變質(zhì)與降解：在運(yùn)輸、保存時尤應(yīng)注意；注意有效期c.

種類：國際標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（2）標(biāo)記物a.對標(biāo)記物的要求比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強(qiáng)度高生物活性及免疫活性與標(biāo)記前改變小放射化學(xué)純度高：應(yīng)>95%

穩(wěn)定性好：標(biāo)記的同位素不易脫落第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五b.標(biāo)記方法：氯胺-T法：最常用的125I標(biāo)記法，I與酪氨酸共價結(jié)合，方法簡便，但易造成蛋白質(zhì)的損傷乳過氧化酶法：

Iodogen（氯甘脲）法：固相法，標(biāo)記率較高，損傷小，反應(yīng)時間長置換法：3H最常用c.標(biāo)記產(chǎn)物的純化：常用Sephadex層析，也可用硅膠G薄板層析或HPLC分離d.標(biāo)記產(chǎn)物的鑒定：常用RIA法最大結(jié)合百分率標(biāo)準(zhǔn)曲線比較法e.半抗原的標(biāo)記：必須先連接載體，常用牛血清白蛋白（BSA），再對載體作標(biāo)記第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（3）特異性結(jié)合抗體a.

對特異性結(jié)合抗體的要求：親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用K值表示，反映靈敏度特異性高：與待測抗原的結(jié)合力高，而與待測抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)）低滴度（效價）高：指結(jié)合50%標(biāo)記抗原時抗體的稀釋度高穩(wěn)定性好：能長期保存，化學(xué)性質(zhì)、效價穩(wěn)定b.

抗體的制備選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊

應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點(diǎn)）、間隔時間（加強(qiáng)）與次數(shù)第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五

c.抗體的純化

去除雜抗體：用抗原吸附法提取特異性IgG：先用鹽析法粗提，再用離子交換層析或親和層析純化d.

抗體的鑒定鑒定內(nèi)容：效價、親和力、特異性鑒定方法：效價（瓊脂單擴(kuò)）、特異性（瓊脂雙擴(kuò)）、RIA

e.單克隆抗體的使用：用于IRMA或RIA，特異性高不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五5.競爭性放射免疫分析法的建立（1）反應(yīng)方式a.

平衡法：標(biāo)記抗原與待測抗原、特異性抗體同時加入溫育b.順序法：先加入待測抗原、特異性抗體溫育一段時間后再加入標(biāo)記抗原?？商岣叻磻?yīng)靈敏度c.STAT法：反應(yīng)未達(dá)平衡時即測定，較難控制反應(yīng)條件（2）反應(yīng)體系a.

緩沖液：常用0.05~0.1mol/LpH7.4~7.5磷酸或Tris-HCl緩沖液。根據(jù)需要定b.

反應(yīng)體積：小體積可提高靈敏度，但增大了誤差c.

反應(yīng)時間：d.

反應(yīng)溫度：e.

反應(yīng)物比例：減少抗體與標(biāo)記的用量可提高靈敏度；增加抗體與標(biāo)記的用量可擴(kuò)大測定范圍第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（3）分離方法a.

對分離方法的要求：使結(jié)合部分（B）與游離部分（F）盡可能分離完全分離后便于放射性測量分離效果不受外界干擾因素的影響操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好與游離標(biāo)記物的非特異性結(jié)合盡可能小試劑來源廣泛、價格低廉b.

常用的分離方法

二抗法：非特異性低，但沉淀較差

PEG法：沉淀較好，但非特異性高二抗-PEG法：較好，現(xiàn)常用磁化顆粒法：固相法：現(xiàn)較常用第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（4）添加劑的問題a.

防腐劑：低濃度NaN3

對分析的影響小b.

抗凝劑：EDTA、肝素對分析無影響c.

抑肽酶：對一般分析無影響第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五6.放射免疫分析的數(shù)據(jù)處理（1）數(shù)據(jù)處理的基本步驟a.

作圖法b.數(shù)學(xué)模型法（2）幾種數(shù)學(xué)模型a.

一般多項(xiàng)式函數(shù)：普適性差，現(xiàn)基本不用b.

直線法：logit-lg轉(zhuǎn)換c.

四參數(shù)Logistic模型：目前常用第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五7.放射免疫分析的質(zhì)量控制（1）放射免疫分析中的誤差及引起誤差的原因a.

系統(tǒng)誤差：由于某些特定的原因造成的帶有傾向性的誤差試劑誤差：標(biāo)準(zhǔn)品不準(zhǔn)；標(biāo)記物變質(zhì)；抗體失效；分離劑的影響儀器誤差：測量儀器不準(zhǔn)；加樣器不準(zhǔn)分離誤差：分離不完全或失誤數(shù)據(jù)處理誤差：選用數(shù)學(xué)模型不當(dāng)b.隨機(jī)誤差：偶然因素造成的誤差同位素計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)漲落第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（2）放射免疫分析的質(zhì)量控制指標(biāo)a.

精密度：即重復(fù)性，是評價隨機(jī)誤差的指標(biāo)，用標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、變異系數(shù)（CV）、精密度圖（PDP）表示b.

準(zhǔn)確度：指測定值與真值的符合程度，偏離程度叫偏差，常以偏離真值的百分比表示，常用回收試驗(yàn)及平行性實(shí)驗(yàn)來評價c.靈敏度：指測定方法的最小可測值，即能與零劑量相區(qū)別的最小劑量，以零劑量點(diǎn)結(jié)合率的均數(shù)減兩個標(biāo)準(zhǔn)差后的結(jié)合率的對應(yīng)值作為最小可測值d.

特異性：常用交叉反應(yīng)率來表示e.

穩(wěn)定性：即批間的重復(fù)性，常以劑量反應(yīng)曲線參數(shù)的穩(wěn)定性來評價，主要有零管結(jié)合率（B0%）、非特異性結(jié)合率（NSB）、劑量反應(yīng)曲線函數(shù)、相關(guān)系數(shù)f.

臨床有效性：診斷符合率，假陰性率、假陽性率第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五（3）日常檢測工作中的內(nèi)部質(zhì)量控制a.

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的批內(nèi)質(zhì)量控制b.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的批間質(zhì)量控制c.

實(shí)驗(yàn)室之間的外部質(zhì)量控制：對同一樣品在不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果作評判第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五8.放射免疫分析的臨床應(yīng)用臨床常用近200種（1）腫瘤相關(guān)抗原的測定：AFP、CEA、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA等（2）激素的測定：下丘腦-垂體-甲狀腺軸激素，下丘腦-垂體-性腺軸激素，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸激素，胃腸道激素，心血管激素，甲狀旁腺素與降鈣素，生長激素等（3）非激素蛋白質(zhì)的測定：鐵蛋白、各種尿微量蛋白、銅藍(lán)蛋白、肌紅蛋白、血栓素、III型前膠原肽、層黏蛋白等（4）酶的測定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE等（5）藥物及維生素的測定：地高辛、葉酸、VitB12等（6）免疫分子的測定：各種Ig、抗DNA、IL、CD、CIC（7）病原學(xué)研究：現(xiàn)已基本淘汰，但細(xì)菌代謝產(chǎn)物的測定仍有一定的價值（8）其它：甘膽酸、透明質(zhì)酸等第17頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五二、熒光免疫分析技術(shù)（Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA）

1941年Coons等發(fā)明，最早建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)用熒光素標(biāo)記抗體或抗原，借助熒光檢測儀察看熒光現(xiàn)象或測量熒光強(qiáng)度，從而判斷抗原或抗體的分布或含量第18頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五常用熒光免疫的類型（1）熒光免疫染色：主要用于抗原抗體的定位，用熒光顯微鏡觀察（2）熒光免疫測定a.熒光偏振免疫測定（FPIA）b.熒光酶免疫測定（FEIA）（3）時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）第19頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五三、酶免疫測定（EIA）1.均相酶免疫測定法：

主要用于測小分子抗原。酶標(biāo)抗原與待測抗原競爭結(jié)合定量抗體2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：

為固相、非均相酶免疫測定法，目前應(yīng)用最廣泛的定性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，也可用于定量分析。1971年vanWeeman（荷）等發(fā)明3.生物素-親和素系統(tǒng)免疫檢測法生物素標(biāo)記一抗或二抗，酶標(biāo)記親和素4.斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)

用醋酸纖維素膜為固相載體（1）斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)（2）斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)（3）斑點(diǎn)免疫金層析試驗(yàn)第20頁，共21頁，2023年，2月20日，星期五四、發(fā)光免疫分析技術(shù)（