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文檔簡介
第一節(jié)概述圖8.1花藥(A)和花粉(P)培養(yǎng)的雄核發(fā)育和單倍體植株的各種方式圖解現(xiàn)在是1頁\一共有28頁\編輯于星期四第二節(jié)小孢子的形成和花粉的發(fā)育途徑一、小孢子的正常發(fā)育二、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑1營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑(A型)2生殖細胞發(fā)育途徑3營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑4花粉均等分裂途徑現(xiàn)在是2頁\一共有28頁\編輯于星期四一、小孢子的正常發(fā)育第一期:四分孢子形成期第二期:單核期特點:特化的細胞壁逐漸形成??煞譃椋簡魏嗽?、中、晚(靠邊)第三期:雙核期第四期:三核期現(xiàn)在是3頁\一共有28頁\編輯于星期四二、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑1、營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑(A型)花粉
生殖核(?。?-----不分裂或分裂幾次后退化營養(yǎng)核(大)-----經(jīng)多次分裂而形成多細胞團,并迅速增殖而突破花粉壁,細胞持續(xù)分裂形成類胚體或愈傷組織,最后形成單倍體植株
常見的植物:煙草、大麥、光葉曼陀羅、小麥、小黑麥和辣椒現(xiàn)在是4頁\一共有28頁\編輯于星期四2、生殖細胞發(fā)育途徑只在天仙子中出現(xiàn)完全不再分裂只分裂有限幾次即停止營養(yǎng)細胞生殖細胞多次分裂多細胞團發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株現(xiàn)在是5頁\一共有28頁\編輯于星期四3、營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑營養(yǎng)細胞多次分裂大的多細胞團生殖細胞多次分裂小的多細胞團同時發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株只見于南洋金花中DNA復制兩種營養(yǎng)核發(fā)生融合發(fā)育2n、3n或4n胚狀體有兩種情況12現(xiàn)在是6頁\一共有28頁\編輯于星期四4、花粉均等分裂途徑這個途徑在南洋金花中相當普遍生殖細胞多次分裂多細胞團發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株營養(yǎng)細胞花粉均等分裂營養(yǎng)核生核核現(xiàn)在是7頁\一共有28頁\編輯于星期四第三節(jié)花藥培養(yǎng)概念:花藥培養(yǎng)(antherculture):指用無菌操作技術將成熟或未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,誘導花粉單性發(fā)育形成植株的過程?,F(xiàn)在是8頁\一共有28頁\編輯于星期四一、花藥培養(yǎng)的一般操作程序1.培養(yǎng)基的選擇2.材料選取3.材料預處理4.材料消毒5.接種6.脫分化培養(yǎng)7.再分化培養(yǎng)8.花粉植株移植9.染色體加倍現(xiàn)在是9頁\一共有28頁\編輯于星期四1.培養(yǎng)基的選擇NitschH、MS被廣泛用于雙子葉植物的花藥培養(yǎng)。B5:被廣泛用于十字花科及豆科植物的花藥培養(yǎng)。禾谷類植物的花藥培養(yǎng),早期多采用Miller培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基和馬鈴薯2號培養(yǎng)基。Sunderland(1984)設計了C17培養(yǎng)基,用于水稻、小麥、大麥、小黑麥、黑麥、玉米和甘蔗等禾谷類作物的花藥培養(yǎng)?,F(xiàn)在是10頁\一共有28頁\編輯于星期四2.材料選取植物種減數(shù)分裂中期減數(shù)分裂晚前期四分體單核期雙核期成熟期水稻小麥玉米油菜大麥番茄茄子辣椒擬南芥菜甘藍蘋果葡萄煙草小黑麥小黑麥×羊茅楊樹00000000000000000000不同植物花藥培養(yǎng)的合適花粉發(fā)育時期現(xiàn)在是11頁\一共有28頁\編輯于星期四3.材料預處理低溫:高溫生長素其他方法處理常能提高愈傷組織和苗分化的頻率?,F(xiàn)在是12頁\一共有28頁\編輯于星期四4.材料消毒取回的材料,在接種前進行表面滅菌,一般用70~75%酒精,將表面擦洗即可?,F(xiàn)在是13頁\一共有28頁\編輯于星期四5.接種在無菌接種室或超凈工作臺上進行接種操作,采用直徑3cm的試管,每管接種花藥30~60粒。必須注意:在操作過程中,不應使花藥受到損傷,因為損傷常常會刺激花藥壁形成二倍體的愈傷組織。損傷的花藥要淘汰?,F(xiàn)在是14頁\一共有28頁\編輯于星期四6.脫分化培養(yǎng)根據(jù)材料不同,選取適宜的基本培養(yǎng)基、適當?shù)纳L素比例和最適的溫度進行培養(yǎng),經(jīng)10~30天可誘導愈傷組織形成。現(xiàn)在是15頁\一共有28頁\編輯于星期四7.再分化培養(yǎng)愈傷組織增殖到1~3mm大小時,應及時進行再分化培養(yǎng)以獲得花粉植株。要選擇含適當激素水平的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),約經(jīng)20~30天就能誘導苗的分化?,F(xiàn)在是16頁\一共有28頁\編輯于星期四8.花粉植株移植當花粉植株的根系生長良好時,就要及時進行煉苗并移至苗床或大田。試管中花粉植株的移植是一個由異養(yǎng)轉變?yōu)樽责B(yǎng)的過程,必須細心管理,保持幼苗的水分平衡和促進新根的發(fā)生?,F(xiàn)在是17頁\一共有28頁\編輯于星期四9.染色體加倍人工方法:用0.02~0.4%秋水仙素處理植株,雙子葉植物處理生長點或腋芽,禾本科植物在分蘗期處理。單倍體植株可以通過自發(fā)的核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生的二倍體?,F(xiàn)在是18頁\一共有28頁\編輯于星期四現(xiàn)在是19頁\一共有28頁\編輯于星期四二、花藥培養(yǎng)的方法瓊脂固體培養(yǎng)法在培養(yǎng)基中加入0.5~0.7%瓊脂,使培養(yǎng)基呈半固體狀態(tài)。加入的瓊脂量因瓊脂質量而定。瓊脂濃度一般以花藥有1/3浸入而又不沉沒于瓊脂中為宜。液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基厚約0.5cm,若能讓花藥漂浮在液面上,效果最好。加入聚蔗糖(Ficoll),可使花藥不下沉而漂浮在液面上?,F(xiàn)在是20頁\一共有28頁\編輯于星期四第四節(jié)花粉培養(yǎng)
含義:花粉培養(yǎng)(pollenculture)是指把花粉從花藥中剝離出來,在無菌的人工環(huán)境中,以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)使其進一步生長發(fā)育的技術。優(yōu)點:在于花粉已是單倍體細胞,誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株,不會因藥壁、花絲、藥隔等體細胞組織的干擾而形成體細胞植株?;ǚ凼茄芯考毎只瘲l件、胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生機制的較為理想的材料。建立花粉培養(yǎng)實驗系統(tǒng)也可為深入開展細胞工程、遺傳工程和分子生物學的研究提供技術基礎?,F(xiàn)在是21頁\一共有28頁\編輯于星期四一、花粉培養(yǎng)的一般操作程序花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的一般操作程序基本相同?;ǚ叟囵B(yǎng)在材料消毒后要將花粉從花藥中分離出來,再進行接種,其基本操作程序可參照花藥培養(yǎng)?,F(xiàn)在是22頁\一共有28頁\編輯于星期四二、花粉的分離方法自然散落法把花藥從未開的花中在無菌條件下取出,直接插接在無菌培養(yǎng)基上,當花藥自動裂開時,花粉散落在培養(yǎng)基上,移走花藥,讓花粉繼續(xù)培養(yǎng)生長。如果是液體培養(yǎng)基,可接種大量花藥,經(jīng)1~2天,大量花粉散落入培養(yǎng)基中,經(jīng)離心濃縮收集,再接種培養(yǎng)。機械擠壓法優(yōu)點:操作簡便缺點:花粉中混雜有體細胞并且所得的懸浮液中花粉密度也不易控制?,F(xiàn)在是23頁\一共有28頁\編輯于星期四三、花粉培養(yǎng)的方法直接培養(yǎng)法從未經(jīng)任何預培養(yǎng)或預處理的新鮮花藥中分離花粉粒,直接接種到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法為直接培養(yǎng)。預培養(yǎng)法將花藥在基本培養(yǎng)基中預培養(yǎng)3~6天,然后取出花粉,經(jīng)離心沖洗后,在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),密度為105個/ml。培養(yǎng)三周后,可見到各個階段的花粉胚;4~5周后,可發(fā)育成小植株??醋o培養(yǎng)法先把植物的完整花藥放在半固體瓊脂培養(yǎng)基表面,然后在花藥上覆蓋一張濾紙小圓片,用移液管吸取0.5ml花粉懸浮液,密度是每毫升含有20個花粉粒,滴在濾紙圓片上,置于26℃下培養(yǎng)。條件培養(yǎng)法在合成培養(yǎng)基中加入失活的花藥提取物,然后接入花粉進行培養(yǎng)。由于失活的花藥提取物中含有促進花粉發(fā)育的物質,有利于花粉培養(yǎng)成功。添加花藥提取物的濃度隨植物的種類而異。哺養(yǎng)培養(yǎng)微室培養(yǎng)將花粉粒接種在蓋玻片或載玻片制作的一個微室的環(huán)境中進行培養(yǎng)?,F(xiàn)在是24頁\一共有28頁\編輯于星期四四、影響花藥和花粉培養(yǎng)的因素材料的基因型供體植株的生活環(huán)境個體發(fā)育的時期:開花早期的花藥比開花后期的更易產(chǎn)生花粉植株離體花藥預處理低溫預處理:預處理溫度一般最低為2℃,最高為14℃,處理時間短的僅6小時,長的達35天,高溫處理其他處理:低溫、高溫、高滲、飽和水汽、離心磁場、Y射線、pH、CO2、ABA、丁酸鈉、放線菌素D,甲基磺酸乙酯培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分:主要是MS、N6,Blaydes(即Miller),B5、Nitsch。植物激素生長素,如2,4-D、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)等,細胞分裂素如激動素(6-呋喃氨基嘌呤、KT、K2N)、6-BA(6-芐基氨基嘌呤)和玉米(ZT、ZEA)糖:在花藥培養(yǎng)中,其蔗糖濃度一般以2~5%為宜。麥芽糖更佳。pH:當pH值達到5.8時,效果最好。現(xiàn)在是25頁\一共有28頁\編輯于星期四不同濃度蔗糖對煙草花藥出苗率的影響蔗糖(%)接種花藥數(shù)出苗花藥數(shù)出苗率019001711723.932532037.733642539.064791417.72現(xiàn)在是26頁\一共有28頁\編輯于星期四第五節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)的應用及前景一、花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的應用首先,花藥培養(yǎng)可用于常規(guī)育種從品種間雜交的雜種一代或二代、三代的花藥可培育出純合二倍體花粉植株,用于品種的選擇和鑒定。在這種情況下常規(guī)育種所必需的多代自交的程序可以被省去,育種的時間也可大大縮短,這種方法也可以稱為單倍體育種。其次,來源于花粉的純合二倍體可以作為自交系用于
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