植物體細(xì)胞雜交

植物體細(xì)胞雜交第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五主要內(nèi)容體細(xì)胞雜交研究歷程及一般概念體細(xì)胞雜交的一般流程雜交細(xì)胞的鑒定及相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域細(xì)胞雜交的相關(guān)文獻(xiàn)4123我們從以下幾方面來探討植物體細(xì)胞雜交技術(shù)。第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五發(fā)展歷程70年代，技術(shù)建立和完善優(yōu)化1972年獲得煙草種間體細(xì)胞雜種1975年高Ca高pH加PEG融合方法，電融合法大量成功報(bào)道，不少為異想天開的實(shí)驗(yàn)80年代初，由模式植物轉(zhuǎn)向農(nóng)作物/經(jīng)濟(jì)作物，對稱融合到非對稱融合，創(chuàng)造新種質(zhì)的技術(shù)手段80年代末，大量木本植物細(xì)胞融合成功的報(bào)道90年代至今，成為一種育種手段第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五植物體細(xì)胞雜交的幾個(gè)重要進(jìn)展1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這是第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得第一個(gè)屬間體細(xì)胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年，Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五體細(xì)胞雜交的一般概念

體細(xì)胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細(xì)胞雜交（A+B）。第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五

根據(jù)概念，在理論上任何細(xì)胞都可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五體細(xì)胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細(xì)胞雜交有性雜交時(shí)間無季節(jié)限制花期限制，特別是母本的花期親緣關(guān)系一定程度上可以克服有性/嫁接不親和性受親和性影響結(jié)果細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均可以重組、倍性增加雙受精，一般無細(xì)胞質(zhì)重組，倍性不改變第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五幾種不同的表述：

體細(xì)胞雜交：Somatichybridization

細(xì)胞融合：Cellfusion

原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion

無性雜交：asexualhybridization

超性雜交：Parasexualhybridization

超性融合：Parasexualfusion

細(xì)胞操作：Cellmanipulation

細(xì)胞工程（Cellengineering）第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五體細(xì)胞雜交步驟：1原生質(zhì)體的制備2原生質(zhì)體的融合3雜種細(xì)胞選擇4雜種細(xì)胞培養(yǎng)5由愈傷組織再生植株6雜種植株的鑒定第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的過程：第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雜交的兩個(gè)細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁原生質(zhì)體Ａ、Ｂ經(jīng)離心、振動、電刺激用聚二乙醇（ＰＥＧ）誘導(dǎo)融合后的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株再分化（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去壁去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B融合融合的原生質(zhì)體AB再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞AB脫分化愈傷組織雜種植株再分化植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交怎樣才能去除細(xì)胞壁但又不破壞細(xì)胞的生命活性呢？酶解法融合的原理及常用的融合方法？物理方法：離心、振蕩、電刺激化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合可能的類型？怎樣篩選雜種細(xì)胞？植物體細(xì)胞雜交成功的標(biāo)志是什么？利用雜種細(xì)胞獲得雜種植株所依據(jù)的原理？植物細(xì)胞具全能性酶的專一性生物膜的流動性獲得的雜種植株是否能表現(xiàn)出人們所期望的性狀？雜種植株的鑒定雜交細(xì)胞的篩選第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合的方法及步驟聚乙二醇PEG）化學(xué)方法電脈沖物理方法生物方法細(xì)胞融合流程仙臺病毒(Sendaivirus)自發(fā)融合在酶解細(xì)胞壁的過程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個(gè)同核體包含2～40個(gè)核。

形成的原因：由不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成的。

減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細(xì)胞受到強(qiáng)烈的質(zhì)壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。NaNO3處理高PH-高濃度Ga2+飛秒激光誘導(dǎo)融合電融合芯片空間細(xì)胞融合第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞對稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)均為100%）非對稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)不等（相對值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細(xì)胞質(zhì)重組，細(xì)胞核未重組對稱融合（symmetricfusion）也稱標(biāo)準(zhǔn)融合（Standardfusion）非對稱融合（asymmetricfusion）：融合前對一方進(jìn)行處理，使其染色體丟失一部分第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細(xì)胞與體細(xì)胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：

Subprotoplast-protoplastfusion

小原生質(zhì)體：Miniprotoplast

微原生質(zhì)體：Microprotoplast

胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusion第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五微原生質(zhì)體融合

植物微原生質(zhì)體融合是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的將一種植物的一條或幾條染色體轉(zhuǎn)移到另一種植物中的新的非對稱原生質(zhì)體融合的方法。其原理是采用適當(dāng)濃度的微核誘導(dǎo)劑，包含DNA合成抑制劑和紡錘體毒素兩大類，常用的如秋水仙素(COL)、安磺靈(oryzalin)、草胺磷除草劑(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯胺靈(CIPC)等。這些藥劑可使正在分裂的植物細(xì)胞停留在有絲分裂中期，數(shù)小時(shí)后，染色體解開螺旋，形成內(nèi)含多個(gè)微原生質(zhì)體的微核化細(xì)胞，每個(gè)微原生質(zhì)體內(nèi)含有一條或幾條染色體，由于有絲分裂停留在中期，每條染色體的兩個(gè)姐妹染色單體仍在一起，著絲點(diǎn)不分開。通過酶解去掉微核化細(xì)胞的細(xì)胞壁獲得微核化原生質(zhì)體，再用離心等技術(shù)分離出帶有一條或幾條染色體的微原生質(zhì)體，誘導(dǎo)其與完整的受體原生質(zhì)體融合，從而實(shí)現(xiàn)部分基因組的轉(zhuǎn)移。微原生質(zhì)體融合主要包括3個(gè)步驟:微原生質(zhì)體誘導(dǎo)、分離以及富集、微原生質(zhì)體融合和植株再生。第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五

微核是細(xì)胞的染色體發(fā)生斷裂后,細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí),染色體片段不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞,而在細(xì)胞漿中形成直徑小于主核的,嗜色與主核一致,完全與主核分開的圓形或橢圓形微小核，位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1/3，主要由外界損害因素(生物、物理、化學(xué))作用細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大方式：對稱融合（symmetricfusion）－即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對稱融合（asymmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。

第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五1.PEG誘導(dǎo)融合法

【Polyethyleneglycol（PEG）】

PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

PEG作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促進(jìn)原生質(zhì)體融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

在細(xì)胞工程中普遍認(rèn)為聚乙二醇（PEG)分子能改變各類細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合，從而形成雜種細(xì)胞，培養(yǎng)該雜種細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)雜種）可以獲得一些特殊的雜種植株。第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五PEG融合所需試劑融合液：pH5.6CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol

甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5

葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇一般PEG融合細(xì)胞流程P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五NaNO3處理1909年，Kuster在一個(gè)發(fā)生了質(zhì)壁分離的表皮細(xì)胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個(gè)亞原生質(zhì)體的融合。缺點(diǎn)：異核體(heterokaryon)形成頻率不高。第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五高PH-高濃度鈣離子處理1973年，Keller和Melchers，用強(qiáng)堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子（50mmol.L-1)溶液在37℃下處理約30min，兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合。但對于有些原生質(zhì)體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：交變電場部分高頻直流電擊部分第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五電融合的基本過程：

細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起并圓球化。

第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五關(guān)于融合參數(shù)：交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時(shí)間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù)

細(xì)胞電融合過程中,細(xì)胞排隊(duì)、電穿孔和電融合過程都是在一定的電壓條件下完成的。因此,選擇合適的電壓信號成為了細(xì)胞電融合過程的關(guān)鍵所在。與電壓信號相關(guān)的參數(shù)有:電壓波形、電壓幅值、電壓頻率和電壓持續(xù)時(shí)間。第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五飛秒激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)

在實(shí)驗(yàn)中,飛秒激光的中心波長為810nm,脈沖重復(fù)頻率100MHz,脈沖寬度為40fs,作用在被融合細(xì)胞上的平均功率為55mW。首先使用葡聚糖酶去掉酵母細(xì)胞壁,制成原生質(zhì)體。在細(xì)胞融合之前加入體積分?jǐn)?shù)為10%的聚乙二醇(PEG)和0.02mol/L的CaCl2溶液,促使原生質(zhì)體細(xì)胞聚集并緊密接觸。選定緊密接觸的原生質(zhì)體細(xì)胞對,調(diào)整載物臺,使飛秒激光聚焦在質(zhì)膜緊密接觸的區(qū)域,通過光快門控制融合細(xì)胞被輻照時(shí)間。實(shí)驗(yàn)采用0.25s的輻照時(shí)間,以CCD錄像系統(tǒng)監(jiān)測靶細(xì)胞的融合過程。實(shí)驗(yàn)表明,靶細(xì)胞被曝光后160min便可融合成一個(gè)細(xì)胞。第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，如：1）高度的選擇性，可以選擇任意的兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行融合，易于實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞融合。2）激光作用于細(xì)胞所產(chǎn)生的應(yīng)力小、定時(shí)和定位性強(qiáng)、損傷小，從而提高了融合細(xì)胞的生存能力。而且，激光參數(shù)易于控制、操作方便、融合過程利于觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。3）激光操控時(shí)無菌、無毒性。激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)也有自身的缺點(diǎn)，如：

a.技術(shù)不夠成熟，需要進(jìn)一步完善。

b.設(shè)備非常昂貴。

c.它是一種微操作技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)人員和操作技術(shù)要求高，通常需要專門培訓(xùn)。同時(shí)，該技術(shù)每次只能靠人工操作一對細(xì)胞，過程繁瑣，工作效率極差，產(chǎn)量也很低。第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞電融合芯片

在細(xì)胞電融合研究向微芯片技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展過程中，微電極間距縮小到幾十微米，而電融合中細(xì)胞排隊(duì)（約100～700V/cm）與電穿孔（約1～8kV/cm）所需電場條件基本不變。根據(jù)電場強(qiáng)度與加載電壓的關(guān)系式E=V/d（E為電場強(qiáng)度，V為微電極兩側(cè)施加的電壓，d為微電極間距），如果電極間距d=1mm，則排隊(duì)電壓需要10～70V，擊穿電壓則高達(dá)100～800V。如果電極間距縮小到d=50μm，則排隊(duì)電壓需要0.5～2.5V，擊穿電壓只需要5～40V。因此，當(dāng)通過微加工工藝使微電極間距縮小后，所需電壓信號就會大大降低，使細(xì)胞電融合系統(tǒng)成為可用電池供電的便攜式系統(tǒng)。由此可見，融合芯片的研究對細(xì)胞電融合微系統(tǒng)整體的實(shí)現(xiàn)有極其重要的意義，將是該研究的一個(gè)重要內(nèi)容，也是該系統(tǒng)發(fā)展成微全分析系統(tǒng)（micrototalanalysissystem,μ-TAS）的基礎(chǔ)。第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五電融合芯片缺點(diǎn)①常規(guī)電融合系統(tǒng)中異源細(xì)胞的準(zhǔn)確配型難以實(shí)現(xiàn)與生物和化學(xué)融合方法相比，電融合方法由于效率較高、操作簡便、對細(xì)胞無毒害、便于觀察、適于儀器應(yīng)用和規(guī)范操作，成為了主要的手段。不過，常規(guī)融合系統(tǒng)中融合配型難以控制，目標(biāo)配型的產(chǎn)率仍然很低。因此，細(xì)胞電融合技術(shù)的研究進(jìn)入微觀層次，希望通過微操作方法來實(shí)現(xiàn)精確的細(xì)胞操作，從而解決融合配對特異性差的缺陷，同時(shí)提高自動化程度和融合效率。目前，顯微操作的應(yīng)用雖可以提高配型的準(zhǔn)確度，但自動化程度和效率都很低。②現(xiàn)有電融合系統(tǒng)中微電極數(shù)目偏少，難以提高細(xì)胞融合效率現(xiàn)有的電融合系統(tǒng)中融合電極一般只有少數(shù)幾對，可以同時(shí)控制和融合的細(xì)胞有限，造成融合效率不高。③常規(guī)融合儀器中融合電壓很高，有潛在安全隱患，也不利于設(shè)備微型化現(xiàn)有細(xì)胞電融合儀器中電極間距一般為200～1000μm，細(xì)胞電穿孔所需電壓在幾百伏特以上。過高的電壓對實(shí)驗(yàn)者造成不安全因素，同時(shí)，對融合后的細(xì)胞存活率也帶來不利的影響。另外，所需電壓越高，細(xì)胞融合儀設(shè)備制造難度也相應(yīng)提高。設(shè)備研制成本很高，體積較大，難以實(shí)現(xiàn)便攜化，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。④多核融合細(xì)胞比例過高現(xiàn)有細(xì)胞電融合方法中，多細(xì)胞排列成細(xì)胞串的比例很高，由此帶來的一個(gè)嚴(yán)重問題是融合細(xì)胞中多核細(xì)胞（多個(gè)細(xì)胞融合而成）的比例也相當(dāng)高。這種細(xì)胞難以存活和分化，也大大降低了實(shí)際融合效率。⑤電融合芯片技術(shù)不甚完善現(xiàn)有電融合芯片技術(shù)還處于相當(dāng)初級的階段，電極數(shù)量少、細(xì)胞控制困難、融合配對準(zhǔn)確性和融合效率難以同時(shí)得到保障，與其它微流控細(xì)胞研究技術(shù)的集成度也很低。第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五空間細(xì)胞融合技術(shù)

植物細(xì)胞融合過程中由于地球重力的存在,有無液泡的原生質(zhì)體密度差很大,異源細(xì)胞融合率低。

20世紀(jì)80年代以來,在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下,試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù)。空間細(xì)胞融合技術(shù)是直接為生物加工服務(wù)的,例如將抗藥性或胞質(zhì)雄性不育等細(xì)胞質(zhì)基因?qū)肓硪粋€(gè)體細(xì)胞,有可能形成新的核質(zhì)雜種;通過誘導(dǎo)不同種間、科屬間原生質(zhì)體融合,可以打破遠(yuǎn)源雜交不親和性,廣泛組合各種基因型,形成正常重力下無法獲得的新型雜種植株。第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五生物誘導(dǎo)融合法——仙臺病毒法

仙臺病毒是一類被膜病毒，屬于附黏液病毒族，它是多形性顆粒，直徑為50～60nm，由兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合體，外膜上有兩種糖蛋白，一種是HANA蛋白質(zhì)，一種是F蛋白質(zhì)，前者具有神經(jīng)氨酸酶和血凝活性（分子量較大），后者具有融合和溶血作用（分子量較?。?。仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理是：病毒被膜上的兩種糖蛋白可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生相互作用，從而使兩個(gè)細(xì)胞可以互相接觸，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間將產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞質(zhì)橋數(shù)量和橋的體積也在增加，最后相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)就結(jié)合在一起了，形成細(xì)胞凝集塊再通過膜上蛋白質(zhì)分子的重新排列，使膜中脂類分子重排而打開質(zhì)膜，最后導(dǎo)致細(xì)胞融合。第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五

在利用仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中主要包括以下四個(gè)步驟：（1）先將親本細(xì)胞（待融合的細(xì)胞）分別制成懸浮液、混合離心；（2）將沉積細(xì)胞懸于滅活的仙臺病毒懸液里，在4oC低溫下?lián)u動20分鐘，使細(xì)胞形成凝集塊；（3）再將溫度升至37oC，間歇搖動30分鐘，使其融合；（4）洗去病毒，將融合細(xì)胞浮于選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于4oC低溫利于細(xì)胞聚集，在融合時(shí)需要提高溫度，否則融合不會發(fā)生。第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五體細(xì)胞雜種的鑒定及應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種及后代需經(jīng)過雜種性質(zhì)的鑒定，而體細(xì)胞雜種用于育種實(shí)踐時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行再生植株及后代的遺傳分析，一般包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、原位雜交分析以及各種生化及分子標(biāo)記分析。第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五形態(tài)標(biāo)記

形態(tài)標(biāo)記即植物的外部特征，如花的形狀及顏色、果實(shí)(種子)的形狀及顏色、葉型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及對疾病的抗性等。形態(tài)標(biāo)記簡單直觀，但是標(biāo)記少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件和其它修飾基因的影響，并且許多性狀為數(shù)量性狀，由幾個(gè)位點(diǎn)控制，表現(xiàn)為一個(gè)范圍，而不是簡單的性狀差異。第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞標(biāo)記主要包括染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記位點(diǎn)較少，而且對于親緣關(guān)系較近的物種，由于細(xì)胞學(xué)標(biāo)記差別不明顯，所以很難根據(jù)細(xì)胞學(xué)特征來區(qū)分。第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五同工酶標(biāo)記同工酶為共顯性，父本和母本的基因可以同時(shí)在后代中表達(dá)，不受環(huán)境因素影響，中僅有相對穩(wěn)定;分析操作簡便，所需材料較少;不足之處是位點(diǎn)數(shù)較少，植物10~20種同工酶表現(xiàn)出位點(diǎn)的多態(tài)性，覆蓋的基因組范圍有限。第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五染色體原位雜交染色體原位雜交（Genomicinsituhybridization，GISH）是一項(xiàng)利用標(biāo)記的DNA探針與染色體上的DNA雜交，在染色體上直接進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記技術(shù)。通常用同位素或生物素、地高辛標(biāo)記的DNA探針與染色體DNA雜交，通過放射自顯影或通過抗原抗體反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察DNA探針與其互補(bǔ)的DNA序列結(jié)合的位置。最大優(yōu)點(diǎn)是可以顯示在體細(xì)胞雜種中哪條染色體來源于這個(gè)親本，哪條染色體來源于另一個(gè)親本，因而更準(zhǔn)確、直觀。第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五分子生物學(xué)標(biāo)記植物的分子標(biāo)記主要有RApD、盯LP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五下面是研究得出的新品種第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期