植物細(xì)胞組織

植物細(xì)胞組織第1頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

第一節(jié)植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)反應(yīng)器第2頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)反應(yīng)器通常廣義的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)，并以此發(fā)展起來的各種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)反應(yīng)器的研制是植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)向工業(yè)化規(guī)模發(fā)展的關(guān)鍵。第3頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五一、植物細(xì)胞培養(yǎng)過程的特點(diǎn)1．細(xì)胞培養(yǎng)液的性質(zhì)植物細(xì)胞要比微生物大得多。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，其細(xì)胞形態(tài)有明顯的變化。植物細(xì)胞培養(yǎng)液的粘度和微生物發(fā)酵液表現(xiàn)出明顯不同，它隨細(xì)胞濃度的增加而顯著上升。培養(yǎng)液為非牛頓型流體，屬擬塑性流體。

第4頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．植物細(xì)胞培養(yǎng)中的傳遞狀態(tài)氧傳遞的研究對(duì)于產(chǎn)物的有效生產(chǎn)和較好的經(jīng)濟(jì)效益是息息相關(guān)的。植物培養(yǎng)細(xì)胞的需氧量要比微生物深層培養(yǎng)低得多。第5頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五起始kLα和最終細(xì)胞濃度的關(guān)系（培養(yǎng)144h）

第6頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

植物細(xì)胞培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。懸浮培養(yǎng)所用生物反應(yīng)器主要有機(jī)械攪拌反應(yīng)器和非機(jī)械攪拌反應(yīng)器。固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器有填充床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器和膜反應(yīng)器等類型。第7頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1．懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器（l）機(jī)械攪拌式反應(yīng)器機(jī)械攪拌式反應(yīng)器能獲得較高的kLα值（＞100h－1），而植物細(xì)胞培養(yǎng)所需的kLα值一般為5～20h－1

。一般認(rèn)為機(jī)械攪拌式反應(yīng)器應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)存在的主要問題是植物細(xì)胞的細(xì)胞壁對(duì)剪切的耐受力差。從以往的研究來看，對(duì)攪拌器加以改進(jìn)，可以減小攪拌過程中的剪切力，從而使攪拌式反應(yīng)器能更廣泛地應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)上。第8頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五20m3植物細(xì)胞培養(yǎng)裝置流程圖

第9頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五（2）非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器

通常為氣體攪拌式反應(yīng)器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡式反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器，而氣升式反應(yīng)器又可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)兩種形式。第10頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五氣體攪拌式反應(yīng)器

（a）鼓泡式反應(yīng)器（b）內(nèi)循環(huán)氣升式反應(yīng)器（c）外循環(huán)氣升式反應(yīng)器第11頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

氣體攪拌式反應(yīng)器（尤其是氣升式反應(yīng)器）十分適于植物細(xì)胞生長與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。氣體攪拌式反應(yīng)器必須依靠大量通氣輸入動(dòng)量和能量，以保證反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的良好傳質(zhì)、傳熱，并保證不出現(xiàn)死角。但過量的通氣同時(shí)也易于驅(qū)除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對(duì)細(xì)胞生長反而有阻礙作用，因而有時(shí)也需要降低氣體成分的傳質(zhì)系數(shù)。同時(shí)由于植物細(xì)胞的攝氧速率較低，過高的溶氧對(duì)植物細(xì)胞合成次級(jí)代謝產(chǎn)物不利。氣體攪拌式反應(yīng)器第12頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

新疆紫草細(xì)胞培養(yǎng)流程（ALCROF反應(yīng)器）

第13頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器

植物細(xì)胞培養(yǎng)的最大問題是培養(yǎng)中的細(xì)胞遺傳和生理的高度不穩(wěn)定性。固定化細(xì)胞培養(yǎng)可以在一定程度上克服這種傾向。固定化細(xì)胞系統(tǒng)也比懸浮培養(yǎng)更適合于植物細(xì)胞的培養(yǎng)。固定化細(xì)胞包埋于支持物內(nèi)，可以消除或極大地減弱流質(zhì)流動(dòng)引起的切變力。便于連續(xù)操作。第14頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的類型（1）填充床反應(yīng)器（2）流化床反應(yīng)器（3）膜反應(yīng)器第15頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

填充床反應(yīng)器示意圖

流化床反應(yīng)器示意圖

第16頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五幾種流化床反應(yīng)器流程

用藻酸纖維固定化植物細(xì)胞的循環(huán)流化床反應(yīng)器

第17頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

實(shí)驗(yàn)用流化床生化反應(yīng)器

第18頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

錐形流化床反應(yīng)器

第19頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五磁場流化床生化反應(yīng)器

第20頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器示意圖

第21頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

（a）中空纖維

(b)螺旋卷繞反應(yīng)器第22頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、植物組織培養(yǎng)及反應(yīng)器利用高度分化的植物器官、組織培養(yǎng)以提高目的產(chǎn)物含量的研究也日益引起人們的重視。在組織培養(yǎng)研究當(dāng)中，大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)展較為迅速的領(lǐng)域主要有以下幾種。

1．發(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)

2.小植物的大規(guī)?？焖俜敝车?3頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

流化床反應(yīng)器培養(yǎng)黃花蒿發(fā)狀根的流程示意圖1.反應(yīng)器2.空氣出口3.空氣入口4.空氣過濾器5.流量計(jì)6.空氣貯罐7.蠕動(dòng)泵8.無菌水入口9.無菌水貯槽10.熒光燈第24頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

淺層循環(huán)式植株快速繁殖器l.溫度傳感器2.出口管3.反應(yīng)器體4.托板5.進(jìn)口管6.排氣口7.空氣分布管8.溫度調(diào)節(jié)器

9.轉(zhuǎn)換器

第25頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五唐菖蒲原球莖培養(yǎng)流程圖

l.反應(yīng)器2.蠕動(dòng)泵3.培養(yǎng)液貯罐4.通氣口5.培養(yǎng)板

6.支架7.加液口8.出波口9.加液、取液口

第26頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

培養(yǎng)馬鈴薯無菌芽的內(nèi)環(huán)噴霧生物反應(yīng)器A.培養(yǎng)容器B.內(nèi)管C.轉(zhuǎn)能器D.超聲波發(fā)生器E.計(jì)時(shí)器F.液體培養(yǎng)基G.熒光燈H.支架I.不銹鋼網(wǎng)J.植物材料K.空氣出口L.空氣過濾器

第27頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)，建立大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種生物活性物質(zhì)，是一種比較經(jīng)濟(jì)可靠的技術(shù)。具有代表性的有氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)、微載體培養(yǎng)系統(tǒng)、微囊培養(yǎng)系統(tǒng)、大載體培養(yǎng)系統(tǒng)以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。第28頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有兩種類型。一種是非貼壁依賴性細(xì)胞，可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。另一種是貼壁依賴性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。第29頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五l.貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，最初采用滾瓶系統(tǒng)VanWezel在1967年開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。第30頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體系統(tǒng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)①表面積／體積比大。②微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長環(huán)境均一，簡化了這些環(huán)境因素的監(jiān)測和控制。③培養(yǎng)基利用率高。④采樣重演性好。⑤收獲過程不復(fù)雜。⑥放大較容易。⑦勞動(dòng)強(qiáng)度小，占用空間小。影響微載體培養(yǎng)的特殊因素有微載體濃度、接種濃度和攪拌轉(zhuǎn)速等。第31頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2.懸浮培養(yǎng)所謂懸浮培養(yǎng)，是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)，在許多方面又與經(jīng)典的發(fā)酵不同。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險(xiǎn)，培養(yǎng)病毒易失去病毒標(biāo)記而降低免疫能力。第32頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五3.固定化培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)適用于非貼壁依賴性細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)適用于貼壁依賴性細(xì)胞。包埋培養(yǎng)，對(duì)兩類細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)。對(duì)非貼壁依賴性細(xì)胞常用海藻酸鈣包埋，對(duì)貼壁依賴性細(xì)胞常用膠原包埋。第33頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1.分批式操作2.流加式操作3.半連續(xù)式操作4.連續(xù)操作5.灌注培養(yǎng)第34頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器1．通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪切力小，混合性能好。在已開發(fā)的各種形式攪拌器中，籠式通氣攪拌器基本上能符合上述要求。該裝置的主要特點(diǎn)是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時(shí)氣泡直接損傷細(xì)胞。同時(shí)在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中。第35頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Spier設(shè)計(jì)的籠式通氣攪拌器

第36頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

CelliGen籠式通氣攪拌器

第37頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Celligen細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

第38頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和攪拌式生物反應(yīng)器相比，氣升式反應(yīng)器中產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；反應(yīng)器內(nèi)無機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；反應(yīng)器通過直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；反應(yīng)器內(nèi)液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)成分能均勻分布于培養(yǎng)基中。第39頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1000L動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流程圖

第40頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五3．中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方面用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。一般來說，中空纖維是用聚礬或丙烯的聚合物制成。管壁的厚度約50～75μm，直徑為200μm。管壁是半透膜。第41頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器美國Endotronic公司生產(chǎn)的Acusyst－JtTM中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)①培養(yǎng)器體積小，細(xì)胞高密度生長；②濃縮產(chǎn)品；③產(chǎn)物純度高；④自動(dòng)化程度高，細(xì)胞生長周期長。其缺點(diǎn)是由于中空纖維每次生產(chǎn)的消耗品價(jià)格尚貴，如果使用不當(dāng)會(huì)增加生產(chǎn)成本。第42頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)（Acysyst－JrTM）循環(huán)簡圖

第43頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五4．微囊培養(yǎng)系統(tǒng)微囊培養(yǎng)系統(tǒng)具有幾個(gè)特點(diǎn)：①細(xì)胞密度大；②產(chǎn)物單位體積濃度高；③分離純化操作經(jīng)濟(jì)簡便；④抗體活性、純度好。但微囊技術(shù)成功率一般只有50％左右，培養(yǎng)液用量大。囊內(nèi)部分死亡細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的污染。第44頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

微囊技術(shù)操作過程圖解1.懸浮細(xì)胞膠狀液2.成滴器3.膠化小珠4.包被溶液5.顯微鏡下膠囊6.多孔微囊膜7.完成操作后的微囊第45頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五5．大載體系統(tǒng)大載體培養(yǎng)系統(tǒng)是一種新型的大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞裝置，配有先進(jìn)的主要部件，如溶解氧、pH測定以及培養(yǎng)液輸入和產(chǎn)物的收獲均由微機(jī)程控調(diào)節(jié)。該培養(yǎng)系統(tǒng)能連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)月以上，已用于培養(yǎng)10多種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的細(xì)胞株，生產(chǎn)單克隆抗體和干擾素產(chǎn)品。我國于1987年引進(jìn)上述大載體培養(yǎng)系統(tǒng)。第46頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五大載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)①操作控制方便，可隨機(jī)取樣檢測；②附著細(xì)胞密度高；③消耗用品價(jià)格低廉，產(chǎn)物收獲量大，有明顯經(jīng)濟(jì)效益。但該系統(tǒng)不具有細(xì)胞分泌產(chǎn)物的濃縮裝置。第47頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Be11co大載體培養(yǎng)系統(tǒng)組裝簡圖

第48頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五6．微載體培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理是利用固體小顆粒作為載體，細(xì)胞在載體的表面附著，通過連續(xù)攪拌懸浮于培養(yǎng)液中，并形成單層生長、繁殖。由于擴(kuò)大了細(xì)胞的附著面，能充分利用生長空間和營養(yǎng)液，因此大大提高了細(xì)胞的生長效率和產(chǎn)量。第49頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)①具有較高的表面積體積比；②生長環(huán)境均一，條件易于控制，放大容易；③兼具貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，而且是均相培養(yǎng)；④取樣和計(jì)數(shù)簡單；⑤細(xì)胞和培養(yǎng)液易分離；⑥大規(guī)模培養(yǎng)只需對(duì)微生物攪拌式或氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)稍加改進(jìn)即可；⑦適合于培養(yǎng)原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株，它對(duì)生產(chǎn)重組產(chǎn)品來說是必不可少的有效方法。第50頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各種合成的聚合物組成的。其直徑由50μm到數(shù)百μm不等。近年來國外開發(fā)的微載體主要有液體為載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚酰胺泡沫為載體、藻酸鹽凝膠微載體、新型的外被膠原的聚尿烷泡沫載體、磁性微載體。第51頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養(yǎng)系統(tǒng)

國際上微載體系統(tǒng)的研究開發(fā)，大體上沿著2個(gè)方向進(jìn)行：①研究開發(fā)培養(yǎng)和收獲細(xì)胞的新工藝、新設(shè)備包括自控和監(jiān)測系統(tǒng)；②研制開發(fā)新型微載體。第52頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養(yǎng)系統(tǒng)

第53頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)微藻培養(yǎng)反應(yīng)器一、微藻生物技術(shù)的優(yōu)越性（1）光能利用率高。（2）微藻無復(fù)雜的生殖器官，整個(gè)生物量易于收獲、加工和利用。（3）許多微藻經(jīng)誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生特別高濃度的、有商品化生產(chǎn)價(jià)值的化合物。（4）微藻通常沒有有性階段，只有簡單的細(xì)胞分裂周期，能在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成細(xì)胞循環(huán)。第54頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、微藻大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)（1）微藻培養(yǎng)過程要有足夠的光照。（2）氣液傳遞：強(qiáng)化氧解析過程。（3）混合：在藻類培養(yǎng)過程中的混合除了具有促進(jìn)氣液傳遞、液固傳遞，防止細(xì)胞沉降作用外，還必須使細(xì)胞在與反應(yīng)器的表面垂直的方向上能充分混合，否則培養(yǎng)液中的細(xì)胞受光不均勻。（4）培養(yǎng)液性質(zhì)：培養(yǎng)基多采用海水配制第55頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、微藻大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器微藻培養(yǎng)用反應(yīng)器要能提供以下條件：①足夠的光照。②合適的溫度。③合適的無機(jī)碳源（及其他無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)）。④合適的PH。⑤充分混合。⑥避免污染。⑦氧的析出或供給。第56頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微藻大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器敞開式培養(yǎng)反應(yīng)器封閉式光生物反應(yīng)器第57頁，共61頁，