核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用第1頁(yè)/共34頁(yè)主要內(nèi)容一、核磁共振譜的基本內(nèi)容三、核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)的應(yīng)用二、單糖的基礎(chǔ)知識(shí)第2頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振的基本內(nèi)容

核磁共振的基本知識(shí)核磁共振的基本概念核磁共振儀核磁共振的的常用術(shù)語(yǔ)

第3頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振的基本知識(shí)

自旋量子數(shù)（I）：

它表示的是在所有的帶電荷的原子核中，核電荷繞軸自旋，我們就把這種自旋電荷運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)稱(chēng)之為自旋量子數(shù)。在原子核中，I是每個(gè)質(zhì)子和中子各自的自旋的合量。若自旋量子數(shù)總和為偶數(shù)時(shí)，I為零或整數(shù)；若總和為奇數(shù)時(shí)，I為半整數(shù)；如質(zhì)子和中子的總和均為偶數(shù)時(shí)，則I為零。

I為零時(shí)，原子核不具有磁性，所以在核磁共振中不能給出NMR信號(hào)。(如:12C160等）I>0時(shí)，原子核在自旋中會(huì)產(chǎn)生磁偶矩而具有磁性。第4頁(yè)/共34頁(yè)同位素I天然豐度（%）u絕對(duì)靈敏度共振頻率（MHz)/B=7.0463T1H1/299.982.791.003002H10.0150.861.45*10-646.0513C1/21.110.701.76*10-475.4314N199.630.401.01*10-321.6715N1/20.37-0.283.85*10-630.4019F1/21002.630.83282.2331P1/21001.136.63*10-2121.40一些磁核的性質(zhì)第5頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振的基本概念1、是一種吸收光譜2、樣品（溶液狀態(tài)）置于強(qiáng)磁場(chǎng)中（1-12Tesler)3、射頻電子波（波長(zhǎng)=1—10Mum）照射4、具有磁性原子核產(chǎn)生核能級(jí)躍遷而引起電子波的吸收核磁共振第6頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振儀

一個(gè)能產(chǎn)生均勻磁場(chǎng)的強(qiáng)磁鐵，并用繞在磁鐵上的掃描線(xiàn)圈使磁場(chǎng)強(qiáng)度在一個(gè)相當(dāng)窄的范圍內(nèi)連續(xù)地、精確的改變。

射頻振蕩器目前常采用400MHz或500MHz的電磁波，還有更高的600MHz、900MHz。射頻接受器核磁產(chǎn)生共振時(shí)，能檢出被吸收的電磁波能量。記錄儀和積分器能把弱信號(hào)累加并記錄下來(lái)。樣品管座：它規(guī)定了樣品相對(duì)于外加磁場(chǎng)、發(fā)射線(xiàn)圈和接收線(xiàn)圈之間的位置。它能夠一定的速度旋轉(zhuǎn)，使樣品受到均勻磁場(chǎng)作用。另外還有去偶儀、計(jì)算機(jī)、溫度可變裝置和異核射頻振蕩器等第7頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振的常用術(shù)語(yǔ)

化學(xué)位移自旋-自旋偶合第8頁(yè)/共34頁(yè)化學(xué)位移

1、概念：表示不同質(zhì)子的信號(hào)差別的物理量。它是以某種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的共振峰（如：TMS<四甲基硅烷>)為原點(diǎn)，測(cè)出各峰與原點(diǎn)的距離，此距離就稱(chēng)化學(xué)位移。左邊的峰為正，右邊的峰為負(fù)。（原因：分子中處于不同化學(xué)環(huán)境中的核，由于其外圍電子云分布情況各不相同，因而產(chǎn)生不同程度的屏蔽效應(yīng)，因此就會(huì)存在略有區(qū)別的共振頻率。）

2、表示方法：

δ

單位（ppm)由于化學(xué)位移的大小與核所處的化學(xué)環(huán)境有密切關(guān)系，因此就有可能根據(jù)化學(xué)位移的大小來(lái)了解核所處的化學(xué)環(huán)境，即了解有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)。同一個(gè)物質(zhì)在不同規(guī)格型號(hào)的儀器上所測(cè)得的數(shù)值是相同的。

第9頁(yè)/共34頁(yè)內(nèi)標(biāo)物在化學(xué)位移測(cè)定時(shí)，常用的標(biāo)準(zhǔn)物是四甲基硅烷（CH3)4Si，簡(jiǎn)稱(chēng)TMS。TMS用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：TMS化學(xué)性質(zhì)不活潑，與樣品之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)和分子間締合；TMS是一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，四個(gè)甲基有相同的化學(xué)環(huán)境，因此無(wú)論在氫譜還是在碳譜中都只有一個(gè)吸收峰；因?yàn)镾i的電負(fù)性（1.9）比C的電負(fù)性（2.5）小，TMS中的氫核和碳核處在高電子密度區(qū)，產(chǎn)生大的屏蔽效應(yīng)，它產(chǎn)生NMR信號(hào)所需的磁場(chǎng)強(qiáng)度比一般有機(jī)物中的氫核和碳核產(chǎn)生NMR信號(hào)所需的磁場(chǎng)強(qiáng)度都大得多，與絕大部分樣品信號(hào)之間不會(huì)互相重疊干擾；TMS沸點(diǎn)很低（27度），容易去除，有利于回收樣品。但TMS是非極性溶劑，不溶于水。對(duì)于那些強(qiáng)極性試樣，必須用重水為溶劑測(cè)譜時(shí)要用其它標(biāo)準(zhǔn)物。第10頁(yè)/共34頁(yè)自旋-自旋偶合概念：由鄰近核核自旋相互作用而引起的多重峰，稱(chēng)自旋-自旋偶合，自旋偶合引起譜線(xiàn)增多的現(xiàn)象，叫自旋分裂，自旋—自旋偶合產(chǎn)生的多重峰的間隔，叫偶合常數(shù)。耦合是裂分的原因，裂分是耦合的結(jié)果。

常用（

J）表示，單位HzJ值符號(hào)有正負(fù)之分，但是，在進(jìn)行解譜時(shí)，只管絕對(duì)值，不考慮符號(hào)。表示方法：在左上方角注表示相互偶合核之間的間隔數(shù)。如：2J自旋-自旋偶合產(chǎn)生的原因：分子中僅含一個(gè)質(zhì)子或具有等同質(zhì)子（丙酮）時(shí)，它們的譜線(xiàn)只出現(xiàn)單峰，而對(duì)于分子中相鄰碳原子上具有不等的質(zhì)子時(shí)，質(zhì)子間發(fā)生磁性的相互作用，因而出現(xiàn)分裂。核自旋偶合分類(lèi)：

CHCH21偕偶：間隔兩個(gè)單鍵的偶合稱(chēng)偕偶,即：同碳原子上的H之間偶合。表示為：2J

其范圍為10—16Hz2鄰偶：間隔三個(gè)鍵的偶合，稱(chēng)鄰偶，3J其范圍為5－9Hz3遠(yuǎn)程偶合：通常大于三個(gè)鍵間隔時(shí)，J值小于1，常?？床灰?jiàn)偶合作用，但是在П體系中存在。第11頁(yè)/共34頁(yè)測(cè)試NMR的溶劑NMR溶劑的選擇：不產(chǎn)生干擾信號(hào)、溶解性能好、沸點(diǎn)低、與被測(cè)樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。第12頁(yè)/共34頁(yè)單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識(shí)糖的表示式

單糖是多羥基醛或酮。從三碳糖至八碳糖天然界都有存在。每個(gè)糖都有兩個(gè)以上的手性碳原子，它們的命名規(guī)則是：碳原子的排列順序是從醛基或者酮基基團(tuán)為C-1開(kāi)始的。單糖在水溶液中形成半縮醛環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元環(huán)結(jié)構(gòu)的糖——吡喃糖（pyranose）具有五元環(huán)結(jié)構(gòu)的糖——呋喃糖（furanose）糖處游離狀態(tài)時(shí)用Fischer式表示，苷化后成環(huán)用Haworth式表示第13頁(yè)/共34頁(yè)單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識(shí)

醛糖和酮糖甘油醛和二羥基丙酮有相同的化學(xué)組成，C3H6O3，但是不同的結(jié)構(gòu)，它們屬于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。

立體異構(gòu)

甘油醛有一個(gè)不對(duì)成碳原子（手性碳原子），所以它有兩個(gè)立體異構(gòu)體，即D-和L-型。并且互為鏡像異構(gòu)體。第14頁(yè)/共34頁(yè)單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識(shí)Fischer與Haworth的轉(zhuǎn)換及其相對(duì)構(gòu)型

單糖成環(huán)后新形成的一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子稱(chēng)為端基碳（anomericcarbon）。生成的一對(duì)差向異構(gòu)體（anomer）有α、β二種構(gòu)型。從Fischer式看（C1與C5的相對(duì)構(gòu)型）：C1-OH與原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，順式為α，反式為β。從Haworth式看：C1-OH與C5（或C4）上取代基之間的關(guān)系：同側(cè)為β，異側(cè)為α。第15頁(yè)/共34頁(yè)單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識(shí)糖的絕對(duì)構(gòu)型（D、L）絕對(duì)構(gòu)型D-和L-的判斷是從醛基或者酮基開(kāi)始最遠(yuǎn)的手性碳原子。

Fischer式中最后第二個(gè)碳原子上-OH向右的為D型，向左的為L(zhǎng)型。Haworth式中C5向上為D型，向下為L(zhǎng)型。第16頁(yè)/共34頁(yè)單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識(shí)環(huán)的構(gòu)象

呋喃糖五元環(huán)接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，幾乎是固定的結(jié)構(gòu)。

六元環(huán)有船式和椅式構(gòu)象，在溶液或固體狀態(tài)是都是椅式構(gòu)象，不是C1便是1C。[C表示椅式（chairform）]。

以C2、C3、C5、O四個(gè)原子構(gòu)成的平面為準(zhǔn)，C4處面上，C1處面下的標(biāo)為4C1，簡(jiǎn)稱(chēng)C1，反之1C4簡(jiǎn)稱(chēng)1C。Angyal用總自由能來(lái)分析構(gòu)象式的穩(wěn)定性，比較二種構(gòu)象式的總自由能差值，能量低的是優(yōu)勢(shì)構(gòu)象。第17頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)的應(yīng)用一維NMR

1核磁共振氫譜（1HNMR譜）

2碳核磁共振譜（13CNMR譜）二維NMR11H-1HCOSY

2、TOCSY(全相關(guān))譜

3、1H-13CCOSY譜（HMQC）

4、遠(yuǎn)程1H-13CCOSY譜（HMBC）

5、NOESY譜

6、INADEQUATE譜

第18頁(yè)/共34頁(yè)核磁共振氫譜（1HNMR譜）

核磁共振氫譜（1HNMR），也稱(chēng)為質(zhì)子磁共振譜（protonmagneticresonance，pmr），是發(fā)展最早，研究得最多，應(yīng)用最為廣泛的核磁共振波譜。在較長(zhǎng)一段時(shí)間里核磁共振氫譜幾乎是核磁共振譜的代名詞。原因:一：質(zhì)子的天然豐度接近100%,核磁共振測(cè)定的絕對(duì)靈敏度是所有磁核中最大的。在PFTNMR（脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀）出現(xiàn)之前，天然豐度低的同位素，如13C等的測(cè)定很困難。二：1H是有機(jī)化合物中最常見(jiàn)的同位素，1HNMR譜是有機(jī)物結(jié)構(gòu)解析中最有用的核磁共振譜之一。

在多糖中的應(yīng)用

可給出的信號(hào)有在4.3-5.9ppm的異頭質(zhì)子.可以判斷異頭碳的構(gòu)型(δ>5.00為α-型,δ<5.00為β-型).

在1.1-1.3ppm處的6-位脫氧糖的甲基雙峰.

在2.0-2.2ppm處的乙酰氨基的甲基峰.

在3.0-4.2ppm的非常小的區(qū)域中,結(jié)果嚴(yán)重重疊不能給出結(jié)構(gòu)信息.第19頁(yè)/共34頁(yè)碳核磁共振譜（13CNMR譜）1BB譜(Protonbroadbanddecoupling):

最常見(jiàn)的碳譜是寬帶全去偶譜(BB)，又稱(chēng)質(zhì)子噪聲去耦譜，質(zhì)子噪聲去耦譜可以使碳譜簡(jiǎn)化，它損失了13C和1H之間的耦合信息，每一種化學(xué)等價(jià)的碳原子只有一條譜線(xiàn)。碳譜的化學(xué)位移對(duì)核所受的化學(xué)環(huán)境是很敏感的，它的范圍比氫譜寬得多，一般在0-250ppm。對(duì)于分子量在300-500的化合物，碳譜幾乎可以分辨每一個(gè)不同化學(xué)環(huán)境的碳原子，而氫譜有時(shí)卻嚴(yán)重重迭。2DEPT譜(Distortionlessenhencementbypolarizationtransfer):DEPT譜即無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增益法?？稍谫|(zhì)子去偶,又可在質(zhì)子不去偶的條件下測(cè)定,由于BB譜無(wú)法確定譜線(xiàn)所屬的碳原子的級(jí)數(shù)，所以可以通過(guò)改變照射1H的第三脈沖寬度()，使作45，90，135變化并測(cè)定其13CNMR譜。=45時(shí)，CH1和CH2和CH3均為正號(hào)。

=90時(shí)，只有CH1有正信號(hào)，而CH2和CH3信號(hào)均為0。=135時(shí)，只有CH1和CH3有正信號(hào)，而CH2有負(fù)信號(hào)。

在多糖中的應(yīng)用

確定異頭碳的數(shù)目:異頭碳的共振一般出現(xiàn)在90-112ppm.

確定構(gòu)型

:一般來(lái)說(shuō)α-型連接的C1化學(xué)位移比β-型低1.5-3.0,α-型的化學(xué)位移為97-101，β-型103-105，來(lái)確定確定構(gòu)型。

預(yù)言多糖的聚合程度:一般還原末端的C-1出現(xiàn)在90-98ppm間,而取代碳水化合物的C-1(非還原單糖)出現(xiàn)在98-112ppm),因而可預(yù)言多糖的聚合程度.

其他化學(xué)位移的信號(hào):52-57ppm間的共振信號(hào)一般為氨基取代碳的信號(hào).170-176ppm范圍的低場(chǎng)信號(hào)反映有己糖醛酸的羧基或乙?；拇嬖?在60-70ppm間醛糖只有一個(gè)共振峰,而酮糖有兩個(gè).第20頁(yè)/共34頁(yè)α-型β-型異頭氫區(qū)異頭碳區(qū)α-型β-型第21頁(yè)/共34頁(yè)2DH-H相關(guān)譜---H-HCOSYCOSY譜本身為正方形，當(dāng)F1和F2譜寬不等時(shí)則為矩形。正方形中有一條對(duì)角線(xiàn)（一般為左下—右上）。對(duì)角線(xiàn)上的峰稱(chēng)為對(duì)角峰（diagonalpeak）。對(duì)角線(xiàn)外的峰稱(chēng)為交叉峰（crosspeaks）或相關(guān)峰（correlatedpeaks）。每個(gè)相關(guān)峰或交叉峰反映兩個(gè)峰組間的耦合關(guān)系。COSY主要反映3J耦合關(guān)系。它的解譜方法是：取任一交叉峰作為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)它作垂線(xiàn)，會(huì)與某對(duì)角線(xiàn)峰及上方的氫譜中的某峰組相交，它們即是構(gòu)成此交叉峰的一個(gè)峰組。再通過(guò)該交叉峰作水平線(xiàn)，與另一對(duì)角線(xiàn)峰相交，再通過(guò)該對(duì)角線(xiàn)峰作垂線(xiàn)，又會(huì)與氫譜中的另一峰組相交，此即構(gòu)成該交叉峰的另一峰組。第22頁(yè)/共34頁(yè)2DH-H相關(guān)譜---H-HCOSY第23頁(yè)/共34頁(yè)全相關(guān)譜TOCSY、HOHAHATOCSY（TotalCorrelationSpectroscopy）與HOHAHA（HomonuclearHartmannHahnspectscopy）稱(chēng)為總相關(guān)譜?？蓮哪骋粋€(gè)氫核的譜峰出發(fā)，找到與它處于同一耦合體系的所有氫核譜峰的相關(guān)峰。TOCSY和HOHAHA的用途及譜圖的外觀是一樣的，只是實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的脈沖序列不同。TOCSY和HOHAHA譜目前正被越來(lái)越廣泛的使用。第24頁(yè)/共34頁(yè)第25頁(yè)/共34頁(yè)1H-13CCOSY譜（HMQC）HMQC異核多重量子相干（HeteronuclearMultipleQuantumCoherence)C-HCOSY是13C和1H核之間的位移相關(guān)譜。它反映了13C和1H核之間的關(guān)系。它又分為直接相關(guān)譜和遠(yuǎn)程相關(guān)譜，直接相關(guān)譜是把直接相連的13C和1H核關(guān)聯(lián)起來(lái)，矩形的二維譜中間的峰稱(chēng)為交叉峰（crosspeak）或相關(guān)峰（correlatedpeak），反映了直接相連的13C和1H核，在此圖譜中季碳無(wú)相關(guān)峰。第26頁(yè)/共34頁(yè)第27頁(yè)/共34頁(yè)遠(yuǎn)程1H-13CCOSY譜（HMBC）HMBC（1H檢測(cè)的異核多鍵相關(guān)實(shí)驗(yàn)，1HDetectedHeteronuclearMultipleBondCorrelation或LongRangeHeteronuclearMultipleQuantumCoherecel）。遠(yuǎn)程相關(guān)譜則是將相隔兩至四根化學(xué)鍵的13C和1H核關(guān)聯(lián)起來(lái)，甚至能跨越季碳、雜原子等，交叉峰或相關(guān)峰比直接相關(guān)譜中多得多，因而對(duì)于幫助推測(cè)和確定化合物的結(jié)構(gòu)非常有用。

第28頁(yè)/共34頁(yè)NOESY譜和ROESY譜二維NOE譜簡(jiǎn)稱(chēng)為NOESY，它反映了有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中核與核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學(xué)鍵無(wú)關(guān)。因此對(duì)確定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子有著重要意義。NOESY的譜圖與H-HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對(duì)角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個(gè)氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個(gè)氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實(shí)驗(yàn)是由COSY實(shí)驗(yàn)發(fā)展而來(lái)為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時(shí)需對(duì)照它的H-HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除，對(duì)多糖譜可以用此來(lái)判斷多糖的構(gòu)型。當(dāng)遇到中等大小的分子時(shí)（分子量約為1000-3000），由于此時(shí)NOE的增益約為零，無(wú)法測(cè)到NOESY譜中的相關(guān)峰（交叉峰），此時(shí)測(cè)定旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的NOESY則是一種理想的解決方法，這種方法稱(chēng)為ROESY（RotatingframeOverhauseEffectSpectrosc