艾滋病病毒(HIV)初篩實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序

艾滋病病毒(HIV)初篩實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序【目的】：科主任、專業(yè)主管。【方法】【分析前質(zhì)控】一、人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)是人操作的，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識(shí)：1、檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理(ELISA原理)。3、熟悉檢測(cè)技巧，了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)。4、熟悉檢測(cè)試劑性能(包括試劑盒組成，包被片段及其組成)。5、熟悉檢測(cè)儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識(shí)。6、需參加有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，測(cè)試合格后持證上崗。二、室內(nèi)質(zhì)控血清的制備：1、收集陽(yáng)性血清(無(wú)明顯溶血、黃膽、脂肪血和污染血清,到一定量(夠本室使用3-6個(gè)月的量)。3、過濾，除纖維沉淀物。4、稀釋，用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀釋。5、測(cè)定值，和定值參考品進(jìn)行對(duì)比、求值，一般定在CutOff值附近的陽(yáng)性值?！驹噭┖羞x擇】必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品。【試劑盒評(píng)價(jià)】試劑評(píng)價(jià)需要有權(quán)威的血清考核盤(Panel)進(jìn)行檢測(cè)，價(jià)格昂貴，操作繁瑣，一般實(shí)驗(yàn)室不易開展，可以通過以下信息，了解試劑質(zhì)量。1、根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報(bào)告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計(jì)劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑。比例混合或化學(xué)合成)，片段的長(zhǎng)短等判斷試劑的優(yōu)劣。3、參考室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績(jī)。4、根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評(píng)價(jià)結(jié)果，了解市場(chǎng)上試劑的質(zhì)量?jī)?yōu)劣?！緝x器質(zhì)控】為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，所要控制的儀器包括移液器(加樣槍)，水浴箱(溫箱)，洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。1.移液器：ELISA加樣量小(5-100ul)，其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬(wàn)分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)。2.水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中(或溫箱內(nèi))實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有±1℃的誤差。墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞。線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000，新型號(hào)的可測(cè)范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)【酶標(biāo)儀校正程序】可見分光光度計(jì)(波長(zhǎng)精度±0.3nm)于可見光區(qū)對(duì)每個(gè)濾光片進(jìn)行掃描，其檢測(cè)值和標(biāo)定50nm濾光片的檢定選用普魯蘭溶液(校正波長(zhǎng)為630nm)。2、通道差和孔間差檢測(cè)：通道差檢測(cè)是取一只酶標(biāo)板小孔杯(杯底須光滑，透明，無(wú)污染)以酶標(biāo)板架作載體，將其(內(nèi)含200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.500A左右)置于8個(gè)通道的相應(yīng)位置，蒸餾水調(diào)零，于490nm處連續(xù)測(cè)三次,觀察其不同通道的檢測(cè)器測(cè)量結(jié)ulA蒸3、零點(diǎn)飄移(穩(wěn)定性觀察)：取8只小孔杯分別置于8個(gè)通道的相應(yīng)位置，均加入20mV取其均值。計(jì)算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差S，并用±1.96S表示樣品測(cè)量的誤差范圍。雙波長(zhǎng)測(cè)定評(píng)價(jià)：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液(測(cè)定波長(zhǎng)否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以考察雙波長(zhǎng)消除干擾組分的效果。【標(biāo)本的采集和保存】1、標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀2、細(xì)菌污染的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽(yáng)性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)反應(yīng)。3、抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。4、標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般【分析中質(zhì)控】數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。一、加樣1、加樣使用微量移液器(加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。2、每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。4、如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。二、溫育3、反應(yīng)板不宜疊放，注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定控制，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜三、洗滌1、手工洗滌一般采用浸泡方法：1)甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；2)用洗滌液過洗一遍(即注滿2、洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地HRP同樣需要一定的時(shí)間和溫度。2、一定要按照說明書規(guī)定的時(shí)間溫度(一般為37°C，10-15分鐘)恒定反應(yīng)后終止。五、酶標(biāo)儀判讀結(jié)果1、顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色(30分鐘內(nèi))。MB盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm；TMB終止后顯黃色，測(cè)定3、使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板使用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。【分析后質(zhì)控】【報(bào)告方式】2)、COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競(jìng)爭(zhēng)，中和法。3)、COV=N+C(C為常數(shù))，用于間接法。4)、COV=C×P+N(C為常數(shù))，用于間接法。此公式最客觀，但對(duì)廠家要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要基本恒定。二、定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。1、用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。2、現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的【記錄】1、所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè)；原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、