氨基酸紙層析糖旋光的測(cè)定

氨基酸紙層析糖旋光的測(cè)定第1頁/共26頁1.學(xué)習(xí)層析（色譜）分離技術(shù)。2.學(xué)習(xí)旋光度測(cè)定技術(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模旱?頁/共26頁一、氨基酸的紙色譜

色譜法：根據(jù)不同溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，在隨著流動(dòng)相經(jīng)過固定相時(shí)，在兩相之間形成多次平衡，被流動(dòng)相帶動(dòng)移動(dòng)的速度不同，達(dá)到分離效果的方法。固定相：固定不動(dòng)，對(duì)樣品產(chǎn)生保留作用的物質(zhì)。流動(dòng)相：帶動(dòng)樣品，經(jīng)過固定相的物質(zhì)。色譜過程的實(shí)質(zhì)：是樣品在固定相中吸附與解析的過程。第3頁/共26頁按分離機(jī)制，可分為：吸附色譜：分子在兩相中吸附性能不同，進(jìn)行分離分配色譜：分子在兩相中分配系數(shù)不同，進(jìn)行分離離子交換色譜：分子在兩相中離子交換性能不同，進(jìn)行分離體積排阻色譜：體積大的留在固定相的小孔內(nèi)，體積小的先流出。親和色譜：分子在兩相中親和力不同，進(jìn)行分離。電泳色譜、電色譜：離子在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度不同進(jìn)行分離色譜法分類第4頁/共26頁按操作方式不同，又可分為：柱色譜氣相色譜高效液相色譜薄層色譜紙色譜等固定相組分第5頁/共26頁紙色譜：為分配色譜，濾紙為載體，固定相為濾紙上的水分，流動(dòng)相（展開劑）為用水飽和過的有機(jī)溶劑。操作技術(shù)：上行法、下行法、環(huán)行法第6頁/共26頁紙色譜、薄層色譜的一般操作步驟第7頁/共26頁1.制板（紙）第8頁/共26頁將一個(gè)1.5cm長、1cm寬的濾紙，剪成扇子狀，并卷起來濾紙芯兒的制作第9頁/共26頁在濾紙中央，用鉛筆畫一個(gè)半徑0.5cm的圓圈（直徑一角硬幣大?。?。在圓圈中心扎一個(gè)孔，插入準(zhǔn)備好的濾紙芯兒。插入時(shí)，濾紙芯的扇花部分插進(jìn)濾紙孔一小部分，以蓋到培養(yǎng)皿上方時(shí)不碰到液體為準(zhǔn)。第10頁/共26頁2.點(diǎn)樣毛細(xì)管點(diǎn)樣：毛細(xì)管與板（紙）垂直，點(diǎn)樣位置、點(diǎn)樣距離：不被展開劑浸泡、以顯色后點(diǎn)之間易分開為準(zhǔn)。點(diǎn)樣量、樣品濃度：輕輕點(diǎn)一次即可。本次實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)三個(gè)樣品——兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，一個(gè)混合樣品第11頁/共26頁3.展開將薄層板斜放入層析缸中（或?qū)V紙掛在層析缸中），層析缸中流動(dòng)相（展開劑）的量以不浸泡樣點(diǎn)為宜。有些層析缸如下圖，易進(jìn)行先飽和后展開操作，提高重現(xiàn)性和避免邊緣現(xiàn)象。邊緣現(xiàn)象：兩邊高第12頁/共26頁本次紙色譜實(shí)驗(yàn)展開步驟：1.在培養(yǎng)皿中加入適量展開劑2.把點(diǎn)好樣的濾紙放到培養(yǎng)皿上，注意濾紙芯兒不能碰展開劑。蓋上培養(yǎng)皿飽和5~10分鐘。3.把濾紙芯兒壓下去，使濾紙芯兒的另一端稍微扇開，并接觸展開劑，開始展開。4.當(dāng)流動(dòng)相（展開劑）的前沿到達(dá)濾紙邊1cm左右時(shí)，停止展開，立即取出濾紙，用鉛筆畫出展開劑前沿線。5.去溶劑：烘干展開劑前沿線飽和展開畫出展開劑前沿第13頁/共26頁4.顯色可見光下觀察紫外燈下觀察顯色劑顯色：通用：10%硫酸乙醇溶液；碘蒸氣；大部分有機(jī)樣品：磷鉬酸/乙醇溶液專用：碘化鉍鉀—生物堿；三氯化鐵—黃酮；

茚三酮—氨基酸

顯色操作：將茚三酮噴至濾紙潤濕，不易流淌第14頁/共26頁5.計(jì)算比移值Rf

值的意義：定性分析的指標(biāo)評(píng)價(jià)展開劑選擇是否合適、評(píng)價(jià)分離效果薄層層析：Rf0.30～0.80，△Rf≥0.05

紙層析：Rf0.05～0.85，△Rf≥0.05第15頁/共26頁2、影響旋光度的因素測(cè)定波長、濃度、測(cè)定管長度、溶劑、溫度比旋光度：旋光管長度，dm

第16頁/共26頁第17頁/共26頁第18頁/共26頁1）按通電源，預(yù)熱約5min2）零點(diǎn)誤差校正選定并清洗測(cè)定管：用水洗（留意密封墊和玻璃透光片，不要寧得太緊，否則讀數(shù)不準(zhǔn)）裝入水：排氣泡，旋上螺蓋（不易過緊）放入樣品管槽：玻璃泡部位在上部①調(diào)零點(diǎn)視野確定零點(diǎn)誤差：數(shù)值與誤差方向檢查旋光儀零位是否準(zhǔn)確，即在旋光儀未放試管或放進(jìn)充滿蒸餾水的試管時(shí)，觀察零度時(shí)視場(chǎng)亮度是否一致。如不一致，說明有零位誤差，應(yīng)在測(cè)量讀數(shù)中減去或加上該偏差值。

4、旋光儀的使用和旋光度的測(cè)定方法第19頁/共26頁②測(cè)定旋光讀數(shù)：轉(zhuǎn)動(dòng)度盤、檢偏鏡、在視場(chǎng)中覓得亮度一致且暗的位置，再從度盤上讀數(shù)。讀數(shù)是正（順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)）的為右旋物質(zhì)，讀數(shù)是負(fù)（逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)）的為左旋物質(zhì)。

第20頁/共26頁讀數(shù)方法：主尺分180格，每格1°；游標(biāo)尺分10格，每大格0.1°，每小格0.05°

。1.先看游標(biāo)尺0刻度線指向主尺的哪兩個(gè)數(shù)之間：圖中9和10之間則旋光度為9.x2.看游標(biāo)尺刻度線與主尺刻度線重合的位置：圖中游標(biāo)尺的3

則代表0.30因此該物質(zhì)旋光度為右旋9.30°第21頁/共26頁1主尺逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)：左旋0刻度線，也是180度線刻度：(+)179.30(-)0.70第22頁/共26頁右旋右旋左旋左旋+30°，-150°可以說刻度是右旋30度，或左旋150度實(shí)際旋光度是多少，再稀釋一半物質(zhì)后測(cè)定，是15度，表明就是右旋的第23頁/共26頁（3）已知濃度的葡萄糖的測(cè)定：試樣管潤洗、裝入10%葡萄糖溶液（0.1g/ml)，調(diào)零點(diǎn)視場(chǎng)并讀數(shù)。（4）稀釋葡萄糖的測(cè)定，確定旋光方向：取出樣品管，加入葡萄糖的稀釋溶液，調(diào)零點(diǎn)視場(chǎng)并讀數(shù)。（5）未知濃度的葡萄糖的測(cè)定：取出樣品管，加入不知濃度的葡萄糖溶液，調(diào)零點(diǎn)視場(chǎng)并讀數(shù)。（6）結(jié)果處理：扣除零點(diǎn)誤差：同方向減，異方向加。由已知樣算出比旋光度，再結(jié)合未知樣的旋光度，算出未知樣的濃度。第24頁/共26頁左盤刻度右盤刻度平均旋光度值（