氨基酸薄層層析

氨基酸薄層層析第1頁/共28頁如何分離鑒定氨基酸混合液？生物化學與分子生物學實驗教學中心第2頁/共28頁氨基酸的薄層層析

(Thinlayerchromatographyofaminoacids)

第3頁/共28頁實驗目的掌握薄層層析法的一般原理。掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。掌握如何根據(jù)移動速率（Rf值）來鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。第4頁/共28頁層析基本概念層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度而最終被分離。特點：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純化，也可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。第5頁/共28頁層析基本概念固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。包括固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等）和液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進行可逆性的吸附、溶解和交換作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。第6頁/共28頁層析技術(shù)的分類（1）按兩相所處狀態(tài)，可分為液相層析和氣相層析，前者以液體為流動相，后者以氣體為流動相。（2）按操作形式不同，可分為柱層析、薄層層析和紙層析。（3）按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。今天要做的試驗，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作形式又屬于薄層層析，合到一起叫：吸附薄層層析。第7頁/共28頁硅膠薄層層析第8頁/共28頁實驗原理

1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種

一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復進行，而將樣品各組分分離開來）第9頁/共28頁硅膠吸附薄層層析實驗原理吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠

硅膠：表達式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（－Si－OH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.第10頁/共28頁實驗原理硅膠吸附薄層層析的特點：

①硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關(guān)。②硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。③硅膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過高。第11頁/共28頁實驗原理

2.氨基酸與茚三酮的顯色反應

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應生成還原茚三酮、氨及醛，與此同時，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點顯色。第12頁/共28頁實驗原理3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對遷移率—Rf值（rateofflow）來表示。

層析中，物質(zhì)沿溶劑運動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。第13頁/共28頁實驗材料吸附劑：硅膠粘合劑：0.5%的羧甲基纖維素鈉氨基酸的異丙醇溶液

丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展開-顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析樣品：氨基酸混合液第14頁/共28頁器材層析板、尺子、鉛筆燒杯、玻棒、量筒吹風機毛細管、層析缸藥匙烘箱第15頁/共28頁薄層層析裝置第16頁/共28頁操作步驟—薄層板的制備

1、調(diào)漿稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化

70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。第17頁/共28頁層析板制備第18頁/共28頁2cm1cm1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點。每個樣品間相距約1cm。2、取樣：用毛細管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細管柱高5cm。3、點樣：點樣毛細管輕輕接觸薄層表面點樣。加樣后原點擴散直徑不超過2mm。

AlaArgGlyMix輕觸疾起操作步驟—點樣第19頁/共28頁點樣操作第20頁/共28頁操作步驟—

展層、顯色AlaArgGlyMix

將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點。第21頁/共28頁試樣展開過程第22頁/共28頁結(jié)果計算Rf=斑點至原點距離溶劑前緣至原點距離

小心量出斑點中心至原點中心距離，再量出原點中心至溶劑前沿的距離，計算出它們的Ｒｆ值。

根據(jù)Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。第23頁/共28頁Rf值測量第24頁/共28頁數(shù)據(jù)處理樣品ArgGlyAla混合液斑點-原點溶劑前緣-原點Rf值第25頁/共28頁注意事項1.切勿用手直接接觸薄層板面。2.點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴。3.樣