生物工程工程技術(shù)-3課件

第二節(jié)細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過某種工程學(xué)手段，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)?！鞍撞恕仕{(lán)”具有生長期短，耐熱性強(qiáng)和易于貯存等優(yōu)點(diǎn)①1958年，美國Steward在用野生胡蘿卜游離韌皮部細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的標(biāo)本中，觀察到已經(jīng)高度分化的細(xì)胞可以重新分裂，而回復(fù)至胚性細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞工程的舉例一、細(xì)胞的全能性概念：細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能。

原因是生物體的每一個細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個體所必需的全部基因。受精卵的全能性最高在生物的個體發(fā)育中，由于基因在特定時間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞處于離體狀態(tài)。生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）體細(xì)胞比生殖細(xì)胞低很多細(xì)胞分化與細(xì)胞全能性之間的關(guān)系①一個受精卵發(fā)育成一個新個體，細(xì)胞除了經(jīng)過有絲分裂使細(xì)胞數(shù)目增多以外，還必須經(jīng)過細(xì)胞分化，使細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上均發(fā)生穩(wěn)定性的差異，形成不同的細(xì)胞和組織。細(xì)胞分化是一個漸變過程，在胚胎發(fā)育的早期，細(xì)胞外觀上尚未出現(xiàn)明顯變化前，細(xì)胞分化前途就已經(jīng)決定，以后依次漸變，不能逆轉(zhuǎn)，因此分化是一種持久的、穩(wěn)定的變化。細(xì)胞分化與細(xì)胞全能性二、植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是：

植物細(xì)胞的全能性植物組織培養(yǎng)

植物體細(xì)胞雜交離體的植物器官、組織或細(xì)胞

脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化再分化

的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）根或芽等器官植物體1、植物組織培養(yǎng)關(guān)鍵步驟:進(jìn)行滅菌處理；植物激素：細(xì)胞分裂素與生長素之間的濃度比可以調(diào)控植株組培過程中芽和根的形成。當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素濃度比高時，有利于芽的發(fā)生；濃度比低時，有利于根的發(fā)生。愈傷組織再分化過程應(yīng)先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根條件：適宜的養(yǎng)料、激素、溫度和無菌條件1.快速繁殖2.培育無病毒植物3.生產(chǎn)藥物、食品添加劑、香料、色素和殺蟲劑等4.制作人工種子5.轉(zhuǎn)基因植物的培育植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用人工種子是指通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得具有胚芽、胚根、胚軸等結(jié)構(gòu)的植物胚狀體，并且用適當(dāng)方法將胚狀體包裹起來，用以代替天然種子進(jìn)行繁殖的一種結(jié)構(gòu)。人工種子有許多優(yōu)點(diǎn):

首先，它解決了有些作物品種繁殖能力差、結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題。

第二，人工種子可以工業(yè)化生產(chǎn)，提高農(nóng)業(yè)的自動化程度。

第三，人工胚乳中除含有胚狀體發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)外，還可以添加各種附加成分，如固氮細(xì)菌、防病蟲農(nóng)藥、除草劑和植物激素類似物等，有利于幼苗茁壯成長，提高作物產(chǎn)量。

第四，用人工種子播種可以節(jié)約糧食。概念：應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技術(shù)）原理：植物細(xì)胞的全能性優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，可大批量生產(chǎn)取材少培養(yǎng)周期短保持優(yōu)良性狀快速繁殖作物脫毒病毒在作物體內(nèi)逐年積累，會導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差分生區(qū)附近（莖尖、根尖）的病毒極少，甚至沒有采用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)2、植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交是用兩個來自于不同植物的體細(xì)胞融合成一個雜種細(xì)胞，并且把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的方法。

因為不同種生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統(tǒng)的有性雜交方法是不可能做到這一點(diǎn)的。3、植物體細(xì)胞雜交如何去壁？酶解法去壁纖維素酶果膠酶人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合有物理法和化學(xué)法兩大類：

物理法是利用離心、振動、電刺激促使原生質(zhì)體的融合；

化學(xué)法是用聚乙二醇（PEG）等試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合（誘導(dǎo)膜融合、核融合在雜種細(xì)胞第一次有絲分裂時進(jìn)行）雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株纖維素酶、果膠酶植物體細(xì)胞雜交(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)植物體細(xì)胞雜交案例植物體細(xì)胞雜交應(yīng)用常見的植物細(xì)胞培養(yǎng)有：1、花粉培養(yǎng)花粉或花粉洗滌后在培養(yǎng)基上剪碎，培養(yǎng)形成愈傷組織，分化形成根莖，生長為單倍體花粉植株，經(jīng)加倍成為普通植株

花粉培養(yǎng)是目前育種重要手段之一如：1970年蕃茄與馬鈴薯之間的原生質(zhì)體融合成功及雜種植株（pomato)的育成。以色列抗寒番茄的育成植物組織培養(yǎng)的過程離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）再分化根或芽等器官植物體植物組織培養(yǎng)的條件：適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無菌條件案例1紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后本世紀(jì)后期最受人們重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機(jī)理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的復(fù)制受到阻斷而凋亡。1967年美國化學(xué)家Wall和Wani等首先從太平洋紫杉（短葉紅豆杉，Taxus.brevifolia）樹皮中提取出來。該藥于1990年進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗，1992年底獲美國FDA批準(zhǔn)上市。紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中，其中樹皮中的含量最高，大約從12000株成年紫杉樹中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生長周期很長，在世界分布很少。紫杉醇的國際市場價格為450美元/g日本有關(guān)組織從紅豆杉中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，篩選得到細(xì)胞培養(yǎng)4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量達(dá)到了0.05％，比樹皮中紫杉醇的含量高達(dá)10倍。Ketchum從6種紫杉醇屬植物中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，獲得了產(chǎn)生紫杉醇的高產(chǎn)細(xì)胞株，在懸浮培養(yǎng)下，細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇含量超過了20mg/L。清華大學(xué)化工系生物化工研究所通過固液兩步培養(yǎng)法可以在4周內(nèi)獲得20g/L干物質(zhì)，利用代謝調(diào)控技術(shù)在2~3天內(nèi)將紫杉醇的含量提高到0.063%左右。案例2利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然色素—紫草寧紫草寧可用作創(chuàng)傷、燒傷以及痔瘡的治療藥物，同時又因為其漂亮的紫紅色而作為高級色素使用。紫草寧產(chǎn)生于亞洲的多年生植物紫草的根部。但紫草資源嚴(yán)重不足，在日本，紫草已瀕臨滅絕，在我國，紫草（Arnebiaeuchroma)列入了國際二級保護(hù)植物紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草寧的無法滿足市場需求?；瘜W(xué)合成紫草寧的工藝非常復(fù)雜，且最終產(chǎn)率只有0.7％，生產(chǎn)成本昂貴。紫草寧在國際市場上售價高達(dá)7000美元/kg1974年Tabata等就研究了用于培養(yǎng)紫草細(xì)胞的培養(yǎng)基。1981年Tabata和Fujita等又用大的培養(yǎng)容器進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)并獲得了紫草寧衍生物。日本在1983年進(jìn)行紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)紫草寧。我國南京大學(xué)等從1986年開始對該項目進(jìn)行研究，在進(jìn)行大量的研究之后得出，在適當(dāng)?shù)臈l件下，培養(yǎng)的紫草細(xì)胞懸浮物中紫草寧含量占干重的14%，比紫草根中的含量高10倍。二、動物細(xì)胞工程其中，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。動物細(xì)胞工程

常用的技術(shù)手段動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞核移植和胚胎移植動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。動物細(xì)胞培養(yǎng)10代左右幼齡動物組織剪碎胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系50代后原代培養(yǎng)：單個細(xì)胞傳至十代左右傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞株：10到40、50代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)沒發(fā)生改變。細(xì)胞系：超過50代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，可無限增殖。動物細(xì)胞生長特性細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。

要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。細(xì)胞的接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。動物細(xì)胞培養(yǎng)條件1、無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、動物血清等）3、溫度和PH溫度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、氣體環(huán)境O2和CO2（95%空氣和5%CO2）動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等健康細(xì)胞培養(yǎng)：如獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。用于檢測有毒物質(zhì)用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)動物細(xì)胞融合物理法化學(xué)法生物法方法喪失感染活性

（不感染細(xì)胞）保留融合活性

（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）紫外線仙臺病毒融合過程示意圖2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1、許多有重要價值的蛋白質(zhì)生物制品，如病毒疫苗、干擾素、克隆抗體等，都可以借助于動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)。2、用取自燒傷病人皮膚的健康細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，為大面積燒傷的病人移植。

3、培養(yǎng)的動物細(xì)胞用于檢測有毒物質(zhì)。許多致畸、致癌物質(zhì)加入培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細(xì)胞會發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異。根據(jù)變異細(xì)胞占全部培養(yǎng)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，可以判斷某種物質(zhì)的毒性。

4、醫(yī)學(xué)家培養(yǎng)各種正常的或病變的細(xì)胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)。單克隆抗體的概念單:單個細(xì)胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)單克隆抗體的制備及技術(shù)原理什么叫單克隆抗體（monoclonalantibody)？首先從生物體的免疫反應(yīng)談起，當(dāng)外源性物質(zhì)在人體或動物血液中出現(xiàn)時，機(jī)體中有一些淋巴細(xì)胞便會作出反應(yīng)，產(chǎn)生一些特殊的免疫球蛋白，叫抗體，而那些外源性物質(zhì)稱抗原，抗體與抗原能發(fā)生特異結(jié)合，從而清除雜物—免疫反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)肌體的作用?？乖煌?，它所誘發(fā)的抗體也不一樣，如細(xì)菌或病毒表面存在著幾種抗原，因此它們就會對應(yīng)誘發(fā)出幾種不同的抗體。過去：人們?yōu)榱说每贵w，根據(jù)上述原理，反復(fù)注射某種抗原到動物（如：兔、羊、馬），然后從其血清中分離所需的抗體，長期以來，用經(jīng)典方法得到的抗體，存在兩個嚴(yán)重的缺點(diǎn)：1、抗體不均質(zhì)，是一種抗體的混合物，特異性差；因而稱為多克隆抗體。2、產(chǎn)量有限，“克隆”Clone，意為“純系、無性繁殖系”。

單克隆抗體，是由一個雜交瘤細(xì)胞及其后代所產(chǎn)生的抗體，且單一，特異和純化的特性，故有極重要的作用。這項課題由1975年被兩名免疫專家GeorgesKoehler和CesarMilstein解決的。1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。雜交的原理：能產(chǎn)生單一抗體的淋巴細(xì)胞與有增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞，又稱雜交瘤，由于這些雜交中細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)分泌繼承了雙親的遺傳物質(zhì)，因而它們不僅能表現(xiàn)出淋巴瘤細(xì)胞分泌單一抗體的能力，而且還能表現(xiàn)出骨髓細(xì)胞在體外大量繁殖的本領(lǐng)，這樣，雜交瘤變成了一座制造單克隆抗體的理想工廠。制備單克瘤隆抗體的具體方法有三步（一）抗原注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫，取出免疫細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。（二）用選擇培養(yǎng)基，選出雜交瘤細(xì)胞，逐一克隆或擴(kuò)增，從中挑出能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞。（三）將雜交瘤細(xì)胞放在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)基注射到動物的體液中作為腹水癌生長，再分離純單克隆抗體。單克隆抗體的制備抗原注入小鼠體內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞分離B淋巴細(xì)胞細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體能產(chǎn)生抗體能無限增殖既能產(chǎn)生抗體又能無限增殖單克隆抗體的制備單克隆抗體的應(yīng)用

單克隆抗體在疾病的診斷、治療和預(yù)防方面，與常規(guī)抗體相比，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性非常明顯。人們正在研究用單克隆抗體治療癌癥，就是在單抗上連接抗癌藥物，制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既消滅了癌細(xì)胞，又不會傷害健康細(xì)胞。3、動物細(xì)胞融合

與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，誘導(dǎo)融合的方法類似。常用的融合劑有：

聚乙二醇、

滅活的病毒等。應(yīng)用：制備單克隆抗體。4、單克隆抗體的制備注入小鼠細(xì)胞融合分離抗原注入小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體能產(chǎn)生的特定抗體

能在體外培養(yǎng)條件下大量增殖在滅活的仙臺病毒或

聚乙二醇的誘導(dǎo)下融合單克隆抗體的應(yīng)用

1、單克隆抗體在疾病的診斷、治療和預(yù)防方面，與常規(guī)抗體相比，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性非常明顯。

2、人們正在研究用單克隆抗體治療癌癥，就是在單抗上連接抗癌藥物，制成“生物導(dǎo)彈”，