怎樣選擇色譜柱,液相色譜柱的種類與方法開發(fā)課件

液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)奧秘科技/AUMITechnologies（US）內(nèi)容概要色譜基本概念回顧色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜基本概念回顧

分離度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾1.SeparationofCompoundsAandB靈敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification

－柱效－峰形（拖尾因子）

重現(xiàn)性分離度（Ｒ）－保留時間（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－選擇性（α）－柱效（Ｎ）靈敏度

色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響分離度《

-選擇性〈鍵合類型，基質(zhì)表面特性；流動相、溫度

-柱效〈保留體積，粒徑，柱長，基質(zhì)表面特性；流動相，溫度，上樣量，流速峰對稱性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型，流動相，溫度保留體積《柱長，孔隙率，比表面積，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度靈敏度《粒徑，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度流動相《

pH，緩沖鹽種類，溶劑；影響色譜柱性能的主要因素1、色譜柱的構(gòu)型

色譜柱內(nèi)徑色譜柱長度2、

固定相柱填料粒徑比表面積孔徑孔隙率基質(zhì)表面特性：

-表面活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量-耐堿性鍵合類型-官能團(tuán)、是否封尾

-鍵合相的保留行為、耐酸性色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響：長度和直徑色譜柱尺寸對色譜分離的影響：?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低

?長柱(150-250mm)-分辨率高,運行時間長

?窄徑柱(2.1mm)–滿足檢測器和樣品量限制

?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高，抗污染，壽命

制備柱

(內(nèi)徑>10mm)–用于純化制備柱填料對色譜柱性能的影響柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑

硅膠粒徑和類型對柱效的影響d硅膠粒徑和類型對壓力的影響柱填料對C18色譜柱性能的影響：比表面積

每克填料的表面積，與粒度，孔徑有關(guān)比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加(梯度洗脫尤為注意)根據(jù)需要選擇合適的比表面積柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑I

多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍

300?孔徑用于：超過50個氨基酸的肽或25個殘基的低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑II

由于小孔徑填料比表面積大，小分子的保留值在小孔徑填料通常更大條件： C8色譜柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史TypeA：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料來源：有機(jī)硅烷（四乙氧基硅烷）水解/燒結(jié)/酸洗雜化及表面雜化整體柱殼層柱柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II

硅膠純度－金屬含量d固定相對色譜柱性能的影響：硅羥基的影響殘余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動相的pH值大于4.5-5.0時，表面的硅羥基會帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。解決方法封尾雙層表面修飾表面雜化固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響不同長度和體積的鍵合相對表面覆蓋率的影響固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾降低表面硅羥基活性，硅膠表面更加均勻ASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾代表產(chǎn)品：StableBondC18，PolarBondC18，SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5μmBrand

A

C182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm固定相對色譜柱性能的影響：鍵合類型A縱向交聯(lián)：保留和選擇不穩(wěn)定B橫向交聯(lián)：寬pH適用C單體鍵合：重現(xiàn)性好，柱效高D單體（空間保護(hù)）：低pH穩(wěn)定Ｅ極性官能團(tuán)嵌合反相固定相固定相對色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉反相鍵合相的保留行為同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱：

保留值隨含碳量的增加而增加比表面積越大，保留值越大鍵合碳鏈越長，保留越大C18

C8>C3>C1，長鏈之間差別不大≈反相鍵合相的保留行為不同廠家色譜柱的保留值，選擇性與峰型色譜柱：4.6*150mm，流動相：乙腈－0.05M磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0（尿嘧啶）P:

吡啶L:

苯酚N:

N,N-二甲基苯胺

B:

4-丁基苯甲酸J:

甲苯固定相對色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性

低pH值，鍵合相流失高pH值，硅膠溶解影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn)

鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響低pH值，鍵合相流失鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響（II）空間位阻保護(hù)，延緩鍵合相流失固定相對色譜柱性能的影響：鍵合硅膠的穩(wěn)定性高pH值，硅膠基質(zhì)溶解pH9時，色譜柱的穩(wěn)定性固定相對色譜柱性能的影響：

鍵合硅膠的穩(wěn)定性碳雜化，延硅膠緩高pH值水解雜化顆粒：Waters

Xterra表面碳雜化示意圖pH=12條件下的穩(wěn)定性4amines,ACN/1%Ammoniaaqueous=25%:75%,40oC,4.6x150mm,5um

1h200h總結(jié)：如何選擇色譜柱和相應(yīng)的色譜條件了解目標(biāo)化合物的性質(zhì)：結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性了解色譜柱的性質(zhì)粒徑，孔徑，比表面積

>保留強(qiáng)度和柱效；抗污染性基質(zhì)表面特性，鍵合類型>保留強(qiáng)度，選擇性，柱效，對稱性，靈敏度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性選擇相應(yīng)的色譜條件色譜柱選擇（ＩＩ）替代：粒徑，比表面，基質(zhì)表面特性，鍵合類型相似新方法開發(fā)：－粒徑：2umvs3umvs5um（分析時間，靈敏度，儀器，價格，壽命）－內(nèi)徑／柱長：內(nèi)徑3mmvs4.6vs7.8（對分離影響不大，成本）；柱長與粒徑相關(guān)－比表面：２００－４００（低比表面耐污染，高比表面利于分離）－孔徑：在滿足比表面前提下大孔徑較好－硅膠基質(zhì)表面特性：１）盡可能使用高純硅膠；２）盡可能使用低酸性硅膠；３）當(dāng)流動相ｐＨ>９盡可能使用表面雜化；４）使用多硅羥基殘留，可加強(qiáng)對于極性化