真核基因組DNA的分離純化課件

真核基因組DNA的分離純化

核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNA為單鏈環(huán)狀分子；大多數(shù)生物體內(nèi)RNA分子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核生物mRNA分子多數(shù)在3＇端帶有polyA結(jié)構(gòu)。分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性（完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求）；②排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染。③無其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子時應(yīng)去除RNA分子）。分離核酸應(yīng)注意以下幾點：①減少化學(xué)因素對核酸的降解，②減少物理因素對核酸的降解：③防止核酸的生物降解：進(jìn)行核酸分離時最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。一、外周血白細(xì)胞DNA提?。∟aI法）【實驗?zāi)康摹空莆誑aI法提取外周血白細(xì)胞DNA的原理和方法。【實驗原理】

從全血制備白細(xì)胞DNA，可用雙蒸水溶脹紅細(xì)胞及白細(xì)胞膜，釋放出血紅蛋白及細(xì)胞核，使核酸處于易提取狀態(tài)，加NaI破核膜并使DNA從核蛋白中解離，用氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全（異戊醇去泡沫），DNA存在于上層水相中，以37%異丙醇沉淀DNA，離心棄去異丙醇，并重復(fù)操作一次，即可獲得白細(xì)胞DNA。

【實驗材料】1、高速離心機。2、各種所需試劑【實驗方法】1．取新鮮抗凝血100μl置EP管中，離心10000r/min×1min。2．棄上清，加ddH2O200μl，搖勻20s。3．加6mol/LNaI200μl，緩慢倒置搖勻20s。4．于管內(nèi)加氯仿/異戊醇（24:1）400μl，搖勻20s，離心12000r/min×12min。5．吸取上層水相360μl置一新Ep管中，加純異丙醇200μl，搖勻20s。6．室溫放置15min，離心14000r/min×12min。7．小心棄去上清，再加37%異丙醇1ml（勿搖動），離心14000r/min×12min。8．小心棄去異丙醇，晾干。9．加50μlTE緩沖液溶解DNA，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定或-20℃保存。4．0.54～1倍的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀。一般不需在低溫條件下放置。