GP73蛋白基因的克隆與表達(dá)純化,基因工程論文

GP73蛋白基因的克隆與表達(dá)純化,基因工程論文高爾基體糖蛋白-73〔GolgiProtein73,GP73〕又稱Ⅱ型高爾基體膜蛋白(Golgiphosphoprotein2,GOLPH2)和高爾基體膜蛋白1〔Golgimembranepro-tein1,GOLM1〕，因其相對(duì)分子質(zhì)量為7.3104而命名為GP73。新近的研究發(fā)現(xiàn)GP73與肝臟疾病、尤其與肝癌密切相關(guān)，有望成為繼AFP后靈敏度、特異性更高層次層次的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物。但作為新的標(biāo)志物，GP73需要更廣泛的實(shí)驗(yàn)室及臨床對(duì)照試驗(yàn)加以驗(yàn)證。為進(jìn)一步討論GP73與肝癌的關(guān)系，及其在肝癌診治中的作用，本研究從肝癌細(xì)胞系中克隆GP73基因，表示出及純化GP73蛋白，旨在為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1材料來(lái)源原核表示出載體pET-21a(+)-TRX由本實(shí)驗(yàn)室在pET-21a(+)的基礎(chǔ)上改建而成、腫瘤細(xì)胞系HepG2、大腸桿菌DH5、感受態(tài)BL21〔由本實(shí)驗(yàn)室保存〕；RNA抽提試劑盒、DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒、蛋白Marker、T4DNA連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒〔Ferments公司〕；His-tag磁珠純化試劑盒〔日本Toyobo公司〕。1.2目的基因的擴(kuò)增HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，抽提總RNA，以此為模板，RT-PCR擴(kuò)增GP73基因的全長(zhǎng)序列，根據(jù)pET-21a(+)-TRX及GP73的序列，設(shè)計(jì)克隆引物：5-CGCGGATCCGATGATGGGCTTGGGAAACGG-3，3端引物如下：5-CCCAAGCTTGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG-3。在5端和3端引物分別引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和HindⅢ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件：95℃1min，60℃30s，68℃1min30s，35個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)電泳回收純化。1.3酶切及連接反響用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ雙酶切pET22a(+)-TRX及GP73PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分別回收，T4DNA連接酶連接，連接后構(gòu)建pET22a(+)-TRX-GP73。1.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5將100LDH5感受態(tài)細(xì)菌放入提早預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，參加5L連接產(chǎn)物，混勻后冰上靜置30min；42℃熱激90s后，立即置于冰上2min；將熱激后的細(xì)菌參加900LLB液體培養(yǎng)基中〔37℃預(yù)熱〕，100rpm，37℃振搖45min；取100L菌液涂布于含50gmL-1Amp的LB瓊脂平皿上，于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16h。1.5重組質(zhì)粒的鑒定從轉(zhuǎn)化平皿中挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用菌落PCR、雙酶切鑒定。選取經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR均為陽(yáng)性的克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA雙向測(cè)序驗(yàn)證。1.6重組蛋白TRX-GP73的原核表示出及純化從DH5中抽提重組質(zhì)粒pET22a〔+〕-TRX-GP73，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21〔DE3〕中，IPTG誘導(dǎo)表示出。為了獲得蛋白表示出的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度，本實(shí)驗(yàn)選擇的IPTG終濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mmolL-1，并分別于30℃、37℃條件下誘導(dǎo)1h、2h、4h、6h、8h、10h后收集細(xì)菌，進(jìn)行SDS電泳鑒定，選擇最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表示出。然后，按ToYoBoHis-tag磁珠純化試劑盒講明書(shū)步驟純化目的蛋白GP73，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS電泳鑒定。2、結(jié)果2.1目的基因的擴(kuò)增抽提HepG2細(xì)胞總RNA，RNA質(zhì)量好，無(wú)降解，以RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增GP73基因的全長(zhǎng)閱讀框架序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，在1200bp可見(jiàn)清楚明晰條帶，大小與預(yù)期相符。目的基因經(jīng)測(cè)序，大小與理論值一致，無(wú)突變，無(wú)移碼現(xiàn)象。2.2酶切及連接反響pET22a(+)-TRX及GP73PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，37℃水浴過(guò)夜后，1％瓊脂糖凝膠電泳并回收，根據(jù)PCR產(chǎn)物/載體3:1的摩爾比率將雙酶切后的PCR回收產(chǎn)物載體連接。2.3重組質(zhì)粒的鑒定從轉(zhuǎn)化平皿中挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用菌落PCR、雙酶切鑒定〔圖1〕，選取兩者均為陽(yáng)性的克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA雙向測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，其大小與理論值一致，無(wú)突變，無(wú)移碼現(xiàn)象，GP73基因序列已成功插入空載體pET21a(+)-TRX中。結(jié)果表示清楚成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21a(+)-TRX-GP73。2.4重組蛋白TRX-GP73的原核表示出及純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，重組蛋白TRX-GP73的最佳誘導(dǎo)條件為1.0mmolL-1，10h，37℃〔圖2〕。將轉(zhuǎn)入pET21a(+)-TRX-GP73的表示出菌株E.ColiRosetta(DE3)經(jīng)1.0mmolL-1IPTG誘導(dǎo)10h后裂解，分別收集上清和沉淀，SDS電泳發(fā)現(xiàn)GP73主要以可溶性的形式存在于上清中，將上清經(jīng)His-tag磁珠純化試劑盒純化后可在80kD左右見(jiàn)一清楚明晰目的條帶，與預(yù)期相符〔圖3〕。3、討論2000年，美國(guó)學(xué)者Kladney等在研究成人宏大細(xì)胞性肝炎(giant-cellhepatitis,GCH)時(shí)，第一次發(fā)現(xiàn)了定位在高爾基體上的蛋白GP73，人GP73基因位于第9號(hào)染色體，全長(zhǎng)3042bp，編碼大小為73kD的糖蛋白，稱為GP73蛋白質(zhì)研究表示清楚GP73在正常人體的多個(gè)器官組織中均有表示出，揣測(cè)該蛋白質(zhì)具有管家基因功能，但表示出水平相差很大，表示清楚GP73可能存在組織和〔或〕細(xì)胞的特異性調(diào)控。在正常肝臟中，大部分肝細(xì)胞不表示出GP73，僅有少量位于匯管區(qū)的肝細(xì)胞低表示出GP73。2002年，Kladney等發(fā)現(xiàn)GP73高表示出于肝炎和肝硬化患者的肝組織中，表示出量是正常肝組織的70倍，而各病理組之間無(wú)顯著差異。2004年，Iftikhar等研究同樣發(fā)現(xiàn)GP73在急性肝炎和進(jìn)行性肝硬化患者中表示出明顯增高。2005年，Marrero采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對(duì)144例肝癌患者、152例肝硬化患者及56例健康對(duì)照者的血清標(biāo)本進(jìn)行分析，以10個(gè)相對(duì)強(qiáng)度單位作為閥值，GP73檢測(cè)肝癌的靈敏度為69％，特異性為75％。而GP73用于早期肝癌診斷的敏感性為62％，遠(yuǎn)高于AFP〔25％〕。AFP水平低于20gL-1的肝癌患者中，57％〔32/56〕的GP73水平顯著升高。2020年，ShanSG等研究發(fā)現(xiàn)，GP73在血清中的表示出水平隨慢性肝病的進(jìn)展〔肝炎-肝硬化-肝癌〕而逐步升高，提示其可作為慢性肝病患者疾病惡化的預(yù)警指標(biāo)?，F(xiàn)有的研究表示清楚GP73與肝臟疾病密切相關(guān)，尤其在肝癌患者血清及肝癌組織中呈現(xiàn)高表示出，因而有望成為肝癌早期診斷的血清標(biāo)志物。本研究從肝癌細(xì)胞系中克隆GP73基因，采用基因重組技術(shù)構(gòu)建pET-21a(+)-TRX-GP73原核表