第四章酶的來源與篩選

第四章酶的來源與篩選第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二

一、酶的來源與多樣性可以通過兩條途徑1．化學(xué)合成，包括酶的化學(xué)全合成、模擬酶的化學(xué)合成。2．生物合成，從生物中提制。少數(shù)來自于動植物，多數(shù)（80%以上）來源于微生物；

第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二微生物作為酶源的優(yōu)點：(1)種類繁多，易篩選：凡是動植物體內(nèi)有的酶幾乎都能從微生物中找到．并可根據(jù)應(yīng)用特點和要求，篩選出最佳的產(chǎn)酶菌株；(2)繁殖快，發(fā)酵周期短，培養(yǎng)簡便，能通過控制培養(yǎng)條件大幅度提高酶的產(chǎn)量；(3)微生物具有較強的適應(yīng)能力，可采用各種遺傳變異手段，培育出新的、更理想菌株。第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二生物已知種類估計總的種類所占百分率細(xì)菌4760800000～

30000000.2%-0.6%古細(xì)菌＜50050000～

5000000.1%-1%真菌6900015000005%病毒5000130000

4%微生物多樣性賦予的酶開發(fā)的巨大開發(fā)潛力第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二

1)不可培養(yǎng)微生物：指在實驗室內(nèi),采用常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)不出的微生物。（占全部微生物的99%）繞開菌種分離、純化的步驟，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，直接從中尋找有開發(fā)價值的、新的微生物酶基因和新的酶種。

第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2)嗜極端環(huán)境微生物嗜熱微生物（250～350℃）；嗜冷微生物（-10～0℃）；嗜酸微生物（pＨ0）；嗜堿微生物(pＨ11)；嗜鹽微生物[飽和食鹽溶液（含鹽32%或52mol/Ｌ）]；耐有機溶劑微生物第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二二、酶的尋找和發(fā)現(xiàn)

1.

反應(yīng)過程的設(shè)計選擇合適的合成的反應(yīng)途徑、反應(yīng)底物或原料底物：價廉、易合成酶：是否易得、活性、穩(wěn)定性。資料查閱：是否有已確定的能轉(zhuǎn)化該反應(yīng)的或相似反應(yīng)的酶。第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸生物合成的多條途徑第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二brenda(http://www.brenda.uni-koeln.de/)大量關(guān)于酶的信息：包括酶的分類，序列、結(jié)構(gòu)、功能、特性（穩(wěn)定性、最佳pH、最佳反應(yīng)溫度）、底物\產(chǎn)物、催化的反應(yīng)，代謝途徑，抑制劑、激活劑，輔助因子等Ligand數(shù)據(jù)庫http://www.genome.ad.jp/ligand/包含了化合物（除常規(guī)代謝途徑的化合物外還包括其他化合物、如：藥物、多糖）、酶、反應(yīng)。Biocatalysis/biodegradation

代謝途徑和生物轉(zhuǎn)化，主要包含代謝途徑、反應(yīng)、化合物、酶。第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2.酶的尋找獲得新酶的方法⑴篩選新酶：從自然環(huán)境中；⑵發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有酶的新活力（非自然）；⑶利用新的反應(yīng)條件，如改變反介質(zhì)，或新的影響因素（如金屬離子）；⑷酶的改造，主要指利用基因工程技術(shù)，突變酶,定向進化；⑸人工酶。第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二脂肪酶的催化混雜性第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二脂肪酶的催化混雜性第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二3.酶或產(chǎn)酶微生物的篩選

（1）從商品酶庫中篩選（2）從已知菌種來源和菌種保藏中心篩選（3）從自然界發(fā)現(xiàn)和篩選產(chǎn)酶微生物（4）從基因庫篩選第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二從自然界篩選產(chǎn)酶微生物一般步驟：

第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二1.采樣：生物多樣性環(huán)境；高選擇壓力環(huán)境（針對與工藝條件相似的環(huán)境）。2.富集培養(yǎng)：取其所好，投其所抗。3.分離：稀釋涂布、劃線分離。4.篩選

初篩：最普通的篩子——快速簡單，篩去大部分非目標(biāo)株，盡量保留有潛力的候選株。第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二

1）瓊脂板涂布法篩子：以底物或底物類似物為唯一的碳、氮原；底物的轉(zhuǎn)化或產(chǎn)物的形成在瓊脂培養(yǎng)皿上產(chǎn)生的半透明圈。產(chǎn)物的衍生化或絡(luò)合：衍生化或絡(luò)合試劑與產(chǎn)物的某些功能團形成呈色圈。色原性底物：通過酶催化時顏色的變化,對菌群進行可視的直接鑒定。指示菌株：對產(chǎn)物能顯示某種生理變化，如生長、或不生長。第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二水解酶活性檢測中最常用的色原性底物-對硝基苯基衍生物脂肪酶—對硝基苯酯蛋白酶—對硝基苯酰胺糖苷酶—對硝基苯糖苷對硝基苯糖苷水解釋放黃色對硝基苯酚或苯胺第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二其他常用的發(fā)光底物試鹵靈（resorufin）,1-萘酚衍生物。熒光底物-傘形酮（umbelliferone）作為內(nèi)置熒光團的衍生物缺點：只能模擬目標(biāo)真實底物。第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二氧化還原酶活性檢測基于NAD(P)H生成的比色法NAD(P)H在340nm的吸光度可用于檢測信號。間接法：四唑氮藍(lán)（NBT）/吩嗪硫酸甲酯（PMS）法，在PMS存在下，NAD(P)H與黃色的NBT反應(yīng)，可生成藍(lán)紫色甲臜（formazan），吸收波長：580nm。第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二過氧化物酶ABTS(2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)檢測法ABTS可被過氧化物酶氧化呈濃綠色鄰聯(lián)茴香胺-氧化呈紅色。第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2）微孔板懸浮法需有吸光度的變化，可見，或熒光。3）微珠細(xì)胞固定化法Freeman等人設(shè)計的微珠固定化方法,通過物理手段使單個細(xì)胞附著在單個聚丙烯酰胺固體。.4）流式細(xì)胞計數(shù)法細(xì)胞通過高速流動系統(tǒng),排成單行,逐個流經(jīng)檢測區(qū)進行。第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二復(fù)篩：特定篩——慢、精確。使用準(zhǔn)確的定量分析方法，確定反應(yīng)速率、選擇性等。（液、氣相色譜、分光光度法等）毛細(xì)管電泳法，質(zhì)譜法，紅外熱成像法，酶法檢測，酶聯(lián)免疫等多種現(xiàn)代分析方法逐漸應(yīng)用于酶尤其是酶立體選擇性的篩選。第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二5．生產(chǎn)菌的改良誘變、定向突變；代謝調(diào)控。

第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二

4）從基因庫篩選分子篩選(molecularscreening)基于序列(sequence-based)的篩選。

數(shù)據(jù)庫挖掘（Databasemining）基于序列的同源性，從已知酶基因（蛋白）出發(fā)，搜索數(shù)據(jù)庫。

第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二PCR篩選根據(jù)已知酶蛋白，設(shè)計兼并引物，PCR克隆，表達(dá)，活性檢測。基于cDNA文庫和基因組庫的篩選根據(jù)已知酶蛋白，設(shè)計兼并引物，PCR克隆(Southern雜交)，表達(dá)，活性檢測。第25頁，共26頁，2023年，2月2