第四講分子的酶切

第四講分子的酶切第1頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二第二講DNA分子酶切與連接EnzymeDigestionandLigation第2頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二基因工程工具酶1DNA分子酶切2TableofContents本講內(nèi)容第3頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二1基因工程工具酶IntroductionofGeneticEngineeringEnzymes第4頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二基因工程工具酶基因工程工具酶指在分子水平上進(jìn)行基因工程操作時，使用的有助于操作完成的酶類,如限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶、聚合酶等。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。第5頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特一序列，切割DNA。DNA連接酶催化DNA中相鄰的5’磷酸基和3’羥基之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。DNA聚合酶I合成雙鏈cDNA的第二條鏈。缺口平移制作高比活探針。DNA序列分析。填補(bǔ)3’末端。反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析。多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5’羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針。末端轉(zhuǎn)移酶在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾。堿性磷酸酶切除末端磷酸基。重組DNA常用工具酶第6頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2DNA分子酶切RestrictionEndogenousDigestion2.1限制性核酸內(nèi)切酶概述2.2限制性核酸內(nèi)切酶的類型2.3限制性核酸內(nèi)切酶的命名2.4Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性2.5Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件2.6影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第7頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性核酸內(nèi)切酶是一種存在于細(xì)菌體內(nèi)的，能在特異的酶切位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段，又稱為“分子手術(shù)刀”。2.1限制性核酸內(nèi)切酶概述第8頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性內(nèi)切酶切割DNA示意圖EcoRIKpnISmaIEcoRIKpnISmaICKCK第9頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二核酸酶分類核酸酶核糖核酸酶(RNase)-RNA脫氧核糖核酸酶(DNase)-DNA核酸酶(Nuclease)-DNA/RNA核酸外切酶(Exonuclease)核酸內(nèi)切酶(Endonuclease)作用對象作用位置第10頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二核酸外切酶與內(nèi)切酶從核酸分子鏈條末端順次水解磷酸二酯鍵，而將核苷酸切開，生成單核苷酸的酶。核酸外切酶(exonuclease)從核酸分子鏈內(nèi)部水解磷酸二酯鍵，而將核酸鏈切斷，生成寡核苷酸鏈的酶。核酸內(nèi)切酶(endonuclease)第11頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二核酸酶切割方式3’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶第12頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性內(nèi)切酶切割DNA的機(jī)制PHOCCH2OHT水解第13頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二3亞基組成。多功能：內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶。識別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，隨機(jī)切斷在識別位點(diǎn)以外的DNA序列，距識別位點(diǎn)約1000bp不適用于基因工程。I性單一條肽鏈構(gòu)成，單功能，活性僅需Mg2+。特異性識別并切割DNA。切割位點(diǎn)位于識別位點(diǎn)序列范圍內(nèi)。應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶，通常重組DNA操作中內(nèi)切酶即指此。II型二亞基蛋白質(zhì)，雙功能：既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性。切斷位點(diǎn)在識別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，分子克隆操作中無實(shí)用意義。III型2.2限制性核酸內(nèi)切酶的類型第14頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二三類限制性核酸內(nèi)切酶特性比較特性I型II型III型限制性修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM識別序列特異性、非對稱特異性、旋轉(zhuǎn)對稱特異性、非對稱切割位點(diǎn)距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游24-26bp處切割方式隨機(jī)切割特異切割隨機(jī)切割第15頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2.3限制性核酸內(nèi)切酶的命名基本名菌株名屬名首字母大寫;種名頭二字母小寫;斜體表示。特殊菌株中酶在基本名后加株名首字母，正體表示。噬菌體（病毒）或質(zhì)粒基因編碼酶用一個大寫正體字母表示此染色體外遺傳成份。同菌株中多個酶用羅馬數(shù)字表示酶的發(fā)現(xiàn)先后次序。非染色體編碼酶名酶序名系統(tǒng)酶名稱：限制性核酸內(nèi)切酶的系統(tǒng)名稱為R，甲基化酶為M。如R.HindIII表示限制性核酸內(nèi)切酶，相應(yīng)甲基化酶用M.HindIII表示。第16頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性核酸內(nèi)切酶命名示例(流感嗜血桿菌d株I)HaemophilusinfluenzaedI屬名H種名in株名d序名IHindI第17頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2.4Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性單鏈多肽，最適pH為6～8。1切割需Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用。2NaCl對其有抑制作用。3熱不穩(wěn)定，通常溶于50％甘油緩沖液中，貯于–20℃，取出使用須冰浴中放置。4識別與切割序列有嚴(yán)格特異性，基因工程中廣泛應(yīng)用。5第18頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的用途1DNA重組2限制酶（物理）圖譜繪制3基因組突變分析（RFLP分析）4限制酶的部分酶切與完全酶切第19頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列EcoRⅠ：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’HindII：5’…GTYRAC…3’3’…CAYRGT…3’嚴(yán)格專一型非嚴(yán)格專一型（Y:C/T，R:A/G）識別序列具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)，長度一般4-6個堿基對。識別序列分為嚴(yán)格專一型和非嚴(yán)格專一型。第20頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列NotⅠ：5’…GCGGCCGC…3’

3’…CGCCGGCG…5’XcmⅠ：5’…CCANNNNNNNNNTGG…3’3’…GGTNNNNNNNNNACC…5’稀有切割限制酶少數(shù)酶可識別6個以上的核苷酸序列。第21頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列

切割頻率完全隨機(jī)情況下，某種限制性內(nèi)切酶識別序列出現(xiàn)的頻率為1/4n,n為識別序列的核苷酸數(shù)目。6個堿基切割頻率=46=4096第22頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式大多數(shù)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶均在識別位點(diǎn)內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位的酯鍵，產(chǎn)生3’端為羥基、5’端為磷酸基團(tuán)的片段。三種類型切割方式平頭末端5’突出黏性末端3’突出黏性末端第23頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二酶切產(chǎn)生平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃第24頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二酶切產(chǎn)生5’突出黏性末端-C-T-G-OHG…3’-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-’OH-G-C-T-EcoRI37℃-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A--G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-5’3’3’5’第25頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二酶切產(chǎn)生3’突出黏性末端PstI37℃-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5’3’P-G-G-A-H-A-C-G-T-C-C-T-G-C-T-C-T-G-C-A-OH-G-A-G-P5’3’第26頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性內(nèi)切酶切割DNA的結(jié)構(gòu)機(jī)制EcoRI（GAATTC）切割特異性DNA結(jié)構(gòu)BamHI（GGATCC）與非特異性DNA結(jié)構(gòu)BamHI切割特異性DNA結(jié)構(gòu)第27頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二常用的部分限制性內(nèi)切酶第28頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二練習(xí)：質(zhì)粒DNA酶切請用XhoI對該質(zhì)粒進(jìn)行酶切，可以切成多少個片段？每個片段大小是多少？第29頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二兩種特殊的限制酶來源于不同微生物，識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同的酶。同裂酶來源于不同微生物，識別位點(diǎn)不同，但酶切后產(chǎn)生相同的黏性末端。兩種同尾酶切割產(chǎn)生的黏性末端可彼此連接起來。同尾酶HpaII(C↓CGG)MspI(C↓CGG)/(Cm↓CGG)BamHI(G↓GATCC)BglII(A↓GATCT)第30頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二常見同裂酶列表第31頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二同尾酶切割后連接同尾酶切割后連接后，原來的酶切位點(diǎn)將不存在，不能被原來的酶再進(jìn)行切割。第32頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二常見同尾酶列表第33頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2.5II型限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的條件DNA模板內(nèi)切酶緩沖液ddH2O反應(yīng)體系恒溫酶切終止反應(yīng)電泳檢測混勻37℃10mMEDTA,65/80℃處理20min，或純化。第34頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二限制性內(nèi)切酶單位在合適的溫度和緩沖液中,20/50μl反應(yīng)體系中，反應(yīng)1小時，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量。1個活性單位（1U）第35頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二緩沖液（Buffer）組成組分濃度鹽濃度Tris-HCl50mMpH7.5鹽濃度MgCl210mM10mM低鹽酶NaCl0-150mM50mM中鹽酶DTT1mM100mM高鹽酶第36頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二示例：反應(yīng)體系配制組分濃度單個反應(yīng)體積Buffer10×Buffer2.0ulDNA100ng/ul10.0ulEnzyme10U/ul0.1ulddH2O-----7.9ul總體積-----20.0ul第37頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二酶切反應(yīng)終止10mMEDTA(EDTA可鰲合鎂離子),65℃或者80℃加熱處理20min。1280℃處理也不失活的酶，可用苯酚/氯仿抽提去除，然后乙醇沉淀DNA；或用試劑盒純化DNA。第38頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二完全酶切完全酶切內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點(diǎn)都被切開。第39頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二部分酶切部分酶切只有部分酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短反應(yīng)時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化（部分酶切）的目的。第40頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2.6影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素因素原因解決措施酶的純度其他核酸內(nèi)外切酶污染、酶降解重新使用新酶DNA樣品純度雜質(zhì)：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等純化DNA加大酶的用量和反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間第41頁，共44頁，2023年，2月20日，星期二2.6影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素因素原因解決措施DNA甲基化程度大腸桿菌DNA腺嘌呤甲基化酶（dam），在GATC序列中腺嘌呤N6位引入甲基，影響B(tài)clI、MboI等的活性。大腸桿菌DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm），在CCAGG或CCTGG序列中胞嘧啶C5位引入甲基，影響EcoRII等的活性。使用甲基化酶缺失的菌株制備質(zhì)粒DNA酶切溫度與時間標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃；部分酶反應(yīng)溫度不同：如SmaⅠ最適溫度為25℃，T