高通量3D生物打印在打印角膜基質(zhì)等效品的應(yīng)用

———高通量3D生物打印在打印角膜基質(zhì)等效品的應(yīng)用

導(dǎo)讀

人的角膜是眼睛的光學(xué)窗口，同時也是眼部藥物傳遞的第一個生理屏障。目前用于治療眼部角膜磨損的藥物配方，其使用的體外動物模型不能準(zhǔn)確地在結(jié)構(gòu)和成分方面代表人類角膜，因此需要進(jìn)行大量的測試，這種動物體外模型測試成本昂貴，而且也無法準(zhǔn)確地預(yù)測臨床試驗中人類的藥物反應(yīng)。3D生物打印是一種增材制造技術(shù)，細(xì)胞被封裝在"生物墨水'中，模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），隨后以逐層方式沉積到指定的幾何形狀，因此，基于體外的3D生物打印在眼部藥物開發(fā)相關(guān)中構(gòu)建角膜模型等方面具有空間精準(zhǔn)且降低成本的巨大優(yōu)勢。

文獻(xiàn)解讀：

與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)方法不同，3D打印支架模型制造的方法可以在各個方向促進(jìn)增殖和球體的形成。2D培養(yǎng)環(huán)境可能在組織工程領(lǐng)域更相關(guān)，因為研究表明，2D所產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)與其體內(nèi)的表型在形態(tài)和生理上都不同。這些觀察結(jié)果是由于基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致的細(xì)胞反應(yīng)可能不能預(yù)測人體將發(fā)生的事情。因此，利用一種細(xì)胞反應(yīng)被最準(zhǔn)確地再現(xiàn)的培養(yǎng)系統(tǒng)在組織再生中是非常重要的，尤其是3D生物打印培養(yǎng)模型在生理相關(guān)提供更多的預(yù)測數(shù)據(jù)而獲得了越來越多的認(rèn)可，并且降低了藥物篩選進(jìn)行體外測試的經(jīng)濟(jì)成本，這允許利用大量體外患者特異性藥物測試來減少不可預(yù)見的不良反應(yīng)的風(fēng)險，從而更準(zhǔn)確地預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)。

實驗流程及結(jié)果：

在Shallu等人的研究中，設(shè)計了一種角膜等效物的高通量三維生物打印，這可能會解決體外模型的需要。在該3D角膜模型中，成人角膜的平均尺寸被轉(zhuǎn)換為3D形狀，然后轉(zhuǎn)換為G-code文件，由BIOX打印機(jī)（CELLINK）打印。為了保持角膜的曲率，采用立體光刻印刷機(jī)設(shè)計了一個支撐支架模型，該模型可以促進(jìn)6-12個角膜的打印，從而實現(xiàn)高通量打印。將人角膜角質(zhì)細(xì)胞（HCKs）加入到優(yōu)化后的生物墨水中，并打印出負(fù)載細(xì)胞的角膜基質(zhì)等效物。打印后的結(jié)構(gòu)用100mM的氯化鈣交聯(lián)，用Hanks平衡鹽溶液洗滌，在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中37C孵育。▲圖1.人角膜基質(zhì)和基底支撐支架模型的構(gòu)建。(a在AutodeskFusion360中建模的角膜基質(zhì)平均尺寸。(b)單孔模型的明場圖像及半徑。(c)6孔角膜模型的3D模型。(d)用預(yù)制軟件制備12的打印模型。(e)12孔角膜模型的打印路徑。(f)用BIOX打印機(jī)對12個角膜進(jìn)行高通量打印。(g)交聯(lián)后，放置在介質(zhì)中，打印出的角膜。(h)通過字母"c'顯示其透明的角膜圖片。(i)第一天使用倒置顯微鏡拍攝的3D打印的明場角膜圖像。

對打印出的角膜進(jìn)行活死試驗、Alamar試驗以及纖維連接蛋白和肌動蛋白綠色標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行分析。打印出來的眼角膜能夠保持其結(jié)構(gòu)、完整性和清晰度?；钏涝囼灪虯lamar試驗表明，HCKs在2周內(nèi)保持了高活力（95%）。打印角膜中的細(xì)胞顯示纖維連接蛋白和肌動蛋白綠色的表達(dá)?！鴪D2.評價3D生物打印角膜的細(xì)胞活力和免疫熒光染色。(圖a)在第1天對攜帶人角膜角化細(xì)胞（HCKs）的3D打印角膜進(jìn)行活死實驗（合并圖像）。(圖b)在第14天，在攜帶HCK細(xì)胞的3D打印角膜中進(jìn)行活死實驗（合并圖像）。(圖c)第1、5、10和14天在3D打印角膜上的Alamar檢測。使用熒光顯微鏡對3D打印的角膜進(jìn)行免疫熒光染色，以檢測纖維連接蛋白（紅色（圖d））、f-actin（綠色（圖e））、DAPI（藍(lán)色（圖f））和合并圖像（圖g）。

儀器使用：CELLINKBIOX總結(jié)：

該研究設(shè)計了一個高通量3D打印模型，并為快速打印角膜基質(zhì)模型的可行性建立了方法學(xué)。并且優(yōu)化了由膠原蛋白、明膠和海藻酸鈉在生物墨水中的最佳比例配方，打印的角膜透明、光滑，具有所需的曲率，并支持HCKs生長2周。本研究為優(yōu)化和設(shè)計高度組織和仿生結(jié)構(gòu)，結(jié)