實驗四動物血液中dna的提取教案

1/5授課教師常祖明 學(xué)生人數(shù)55課 題血液基因組DNA的提取授課類型授課 授課方法講授、演示教學(xué)用具多媒體、試驗室設(shè)備教學(xué)目的把握雞血DNA提取的原理及方法教學(xué)重點理解試驗過程中每一步操作的目的及原理教學(xué)難點教學(xué)過程一、試驗?zāi)康陌盐针u血DNA把握雞血DNA二、試驗原理哺乳動物的成熟紅細(xì)胞已經(jīng)高度分化，因此當(dāng)中沒有細(xì)胞核，無法提取DNA。禽類的血細(xì)胞那么可以。禽類代謝旺盛，血液中紅細(xì)胞更多，而且紅細(xì)胞中有完好的細(xì)胞核、大量的染色體。且材料易得、經(jīng)濟。用雞血細(xì)胞做試驗材料有兩個緣由。一是由于雞血細(xì)胞核的DNA水脹破，而用動物肝臟細(xì)胞作試驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。三、試驗儀器：55℃2.離心機：8000轉(zhuǎn)、12023轉(zhuǎn)離心管：5ml〔120個〕移液槍：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml5.容量瓶：100ml6.取血針及管四、試驗材料及藥品4.08ml136l〕1.無水乙醇作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。商品信息：瓶/500ml，分析純AR。例互溶。30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。承受防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。制止使用易產(chǎn)生火花的機械設(shè)備和工具。3.5%～18.0酸商品信息：分析純AR，白色塑料瓶/500g，儲存：在濕空氣中有微小潮解，需陰涼密封枯燥保存。觸，有引起爆炸的危急。血液凝固。商品信息：檸檬酸三鈉分析純500克/瓶。理化性質(zhì)：有機化合物，外觀為白色到無色晶體。無臭,有涼快咸辣味。常溫及空氣中穩(wěn)定,在濕空氣150℃失去結(jié)晶水。易溶于水、可溶于甘油、難溶于醇類及其他有機溶劑，過熱分解，在潮濕的環(huán)境中微有潮解，在熱空氣中微有風(fēng)化，其溶液pH值約為8。危害：無毒4.尿素蛋白質(zhì)。商品信息：化學(xué)試劑分析純500克/瓶〔塑料瓶裝〕儲存：密封避光保存。5.十二烷基硫酸鈉(SDS)商品信息：500g/分析純AR。于熱乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。儲存：密封陰涼枯燥保存防止受潮受熱具刺激性，具致敏性。遇明火、高熱可燃。受高熱分解放出有毒的氣體。6.1MTris-HCl(PH8.0)緩沖液DNA被破壞商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。儲存：室溫保存。7.乙二胺四乙酸二鈉〔EDTA-2Na〕作用：配制EDT〔PH8.0〕溶液。螯合Mg2+或Mn2+,DNase于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。商品信息：瓶/250g。pH值約為5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。量的消防器材。儲區(qū)應(yīng)備有適宜的材料收容泄漏物。危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。蛋白酶K300μl10μl〕作用：消化組蛋白，釋放出DNA；消化DNase，進步DNA產(chǎn)量20mg/mL〕1ml/支。理化性質(zhì)：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。儲存：保存在－2012月。2ml〕作用：強蛋白質(zhì)變性劑。商品信息：瓶/250ml。Tris-HCl0.25%8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。儲存：4℃避光保存。說明發(fā)生氧化，不能使用。氯仿〔三氯甲烷〕商品信息：瓶/500ml。儲存：保存在密封的棕色瓶中。危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣漸漸被氧化生成劇毒的光氣。異戊醇異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA商品信息：瓶/500ml。理化性質(zhì)：無色液體，有不開心的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機溶劑。酸類等分開存放，切忌混儲。承受防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。制止使用易產(chǎn)生火花的機械設(shè)備和工具。儲區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和適宜的收容材料。危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸取有麻醉作用。其蒸氣或霧對、皮膚、粘膜和道有刺激作用，可引起神燃燒爆炸。商品信息：500g/瓶。理化性質(zhì)：無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。儲存：無水葡萄糖易吸水結(jié)塊，因此應(yīng)密封保存。危害：無。五、試驗試劑1.75%的乙醇{75ml25ml水}→100ml75%的乙醇2.ACD抗凝劑100ml48ml0.8ml〕{檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖}→加水至100ml，滅菌后備用。3.禽血裂解液100ml51ml，每管1.7ml〕{尿素12g+SDS1g+1MTris-HCl(PH8.0)10ml+ EDTA(PH8.0)20ml}→加水定容至100ml，備用。【0.5MEDTA〔PH8.0100ml{80mlEDTA-2Na}→用NaOH2gPH8.0→定容至100ml→分裝后高壓滅菌備用。注：需參與NaOHPH8.0才能完全溶解。4.氯仿-異戊醇〔24:1〕{氯仿96ml+異戊醇4ml}=100ml，4℃保存5.酚-氯仿-異戊醇〔25:24:1〕共需60ml2ml{氯仿-異戊醇〔24:1〕40mlTris40ml}=80ml，4℃保存6..TE緩沖液PH8.0 50ml{10mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液0.5ml+}→·定容到50ml4℃保存【0.5MEDTA〔PH8.0100ml{水80mlEDTA-2Na}→用NaOH2gPH8.0→定容至100ml→分裝后高壓滅菌備用。注：需參與NaOHPH8.0才能完全溶解?！?0mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液】的配制：10ml{1Mμl}→定容至10ml→10mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液六、試驗步驟5mL20mL7525ml〔酒精：血＝4：1〕目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比無水乙醇效果好，血樣不至于太干澀。酒精:血(4:1)混合的血樣保存時間長，可達4個月。取血樣(酒精:血＝4:1)680L5mL離心管中，80001分鐘，棄上清；目的：去除血樣中大局部的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。800LACD搖勻，80001分鐘800LACD搖勻，80001分鐘，棄上清；胞里DNAK1700L裂解液，10LK〔100g，55℃水浴保溫過夜；目的：DNA裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA別離，抑制細(xì)胞中DNase的活kDNAse，進步DNA55℃水浴保溫過夜可以讓蛋白酶K2mL1202310分鐘；低，易沉淀。吸取上層透亮的DNA5mL離心管中，留意不要攪拌下層的酚－蛋白層；目的：參與飽和酚后溶液分層，上層是透亮的DNA在最下層。加2mL25：24：1，1202310分鐘；目的：參與酚-氯仿-異戊醇進一步去除DNADNA5mL1202310分鐘；DNA-異戊醇在抽提一次可以把酚帶走。吸取上層DNA液900L于另一5mL離心管中，加無水乙醇至滿，顛倒混合，試管中消滅白色團塊，即是DNA；目的：DNA水溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)參與乙醇時，乙醇與DNA不相溶但與水相溶，DNA四周的水分子，使DNA水，DNADNA75%的乙醇，混合，吸出752次；SDS、EDTA-2Na，在氯仿及DNA水，故用7515%的水溶解這些雜質(zhì)除去。將DNA1000LTE緩沖液，-20℃保存；目的：乙醇已揮發(fā)除去，TE緩沖液一可以抑制DnasePH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。七、試驗本卷須知在整個試驗過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作；局部藥品有毒，操作中應(yīng)留意平安防護；剛投入水浴時可