生物化學與分子生物學技術原理

生物化學與分子生物學技術原理第1頁/共255頁

什么是生物化學？

簡單說，生物化學是生命的化學。

生物化學是用化學的理論和方法作為主要手段，研究生物體的基本物質(zhì)的結(jié)構（如Carbohydrates,Lipids,ProteinsandNucleicacid)、性質(zhì)及其生命活動的變化規(guī)律（生命活動如：生長、生殖、代謝、運動等）第2頁/共255頁是研究生物體的化學組成與性質(zhì)（靜態(tài)生化，StaticBiochemistry)，以及機體內(nèi)所進行的化學變化(DynamicBiochemistry)的科學。第3頁/共255頁

分子生物學是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構特征及其重要性、規(guī)律性和相互關系的科學。分子生物學(molecularbiology)是生物化學的重要組成部分。第4頁/共255頁生物化學與分子生物學

同有關學科的關系生物化學與分子生物學是生物學的最深層次；生物化學與分子生物學是化學的最高層次；生物化學與分子生物學為農(nóng)學、醫(yī)學和食品科學提供理論依據(jù)和研究手段；物理學、信息科學和數(shù)學為生物化學與分子生物學提供研究手段。第5頁/共255頁與生物化學的關系最為密切研究方向的側(cè)重點研究方法分子生物學生物大分子的結(jié)構與功能、分子間信息傳遞生物化學與遺傳學生物化學大分子的代謝轉(zhuǎn)化生物化學與化學以及生理學但存在一定的差別第6頁/共255頁分子生物學的三大原則1)構成生物大分子的單體是相同的共同的核酸語言共同的蛋白質(zhì)語言2)生物遺傳信息表達的中心法則相同

DNARNAproteincharacter3)生物大分子單體的排列（核苷酸、氨基酸）的不同

不同的高級結(jié)構不同的生物大分子之間的互作不同的物種特性第7頁/共255頁準備和醞釀階段

時間：19世紀后期到20世紀50年代初。兩點重大突破：確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎物質(zhì)；確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎是DNA。

第8頁/共255頁現(xiàn)代分子生物學的建立和發(fā)展階段時間：從50年代初到70年代初，1953年Watson和Crick的DNA雙螺旋結(jié)構模型作為現(xiàn)代分子生物學誕生的里程碑。主要進展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對蛋白質(zhì)結(jié)構與功能的進一步認識第9頁/共255頁

初步認識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段時間：70年代后－至今基因工程技術作為新的里程碑，標志著人類深入認識生命本質(zhì)并能動改造生命的新時期開始。第10頁/共255頁生物化學中的關鍵技術電泳（1923）生物大分子的分離、分析超離心（1925）蛋白質(zhì)、細胞亞器官的分離；分子量的確定同位素標記（1934）物質(zhì)代謝途徑、生物大分子結(jié)構測定層析（1944）生物大分子的分離純化X-光衍射、NMR：生物大分子結(jié)構測定第11頁/共255頁超速離心（1920S）電泳（1930S）電鏡（1930S）同位素示蹤（1940S）柱層析（1940S）X射線衍射（1950S）氨基酸分析與測序（1950S）核酸雜交（1960S）核苷酸測序（1970S）

重組DNA技術（1970S）DNA合成（1980S）單克隆抗體組織化學（1980S）聚合酶鏈式反應（1980S）分子生物學常用技術第12頁/共255頁1901-2012111項生理醫(yī)學諾貝爾獎中，69項（62%）頒給了生物化學與分子生物學領域第13頁/共255頁發(fā)展歷程分子生物學中重大成就與突破者－－－NobelPrize的獲得者－－－構成了分子生物學發(fā)展的主要內(nèi)容－－－里程碑1910科賽爾Kossel（德）蛋白質(zhì)、細胞及細胞核化學的研究（首先分離到A、T和組氨酸）第14頁/共255頁

1958萊德伯格Lederberg（美）噬菌體轉(zhuǎn)導比德爾

Beadle&泰特姆

Tatum（美）Onegene-oneenzyme紅色面包霉突變體BeadleTatum

Lederberg第15頁/共255頁

1959奧喬亞

Ochoa(美籍西班牙裔)

科恩伯格

Kornberg（美）Ochoa

Kornberg

細菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合成了RNA，基因（DNA）→RNA→蛋白質(zhì)

實現(xiàn)了DNA分子在試管內(nèi)（細菌無細胞提取液）的復制第16頁/共255頁

1962Watson（美）＆Crick（英）

Wilkins（新西蘭）通過DNA分子的X射線衍射研究證實DNADoubleHelixModel第17頁/共255頁DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的深刻意義確立了核酸作為信息分子的結(jié)構基礎;提出了堿基配對是核酸復制、遺傳信息傳遞的基本方式；最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎；為認識核酸與蛋白質(zhì)的關系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎。

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1962肯德魯

Kendrew＆佩魯茨

Perutz（英國）Kendrew

Perutz

測定了肌紅蛋白及血紅蛋白的高級結(jié)構（三級）

成為研究生物大分子結(jié)構的先驅(qū)第19頁/共255頁

1965雅各布

Jacob＆莫諾

Monod（法國）Jacob

Monod

提出并證實了Operon作為調(diào)節(jié)細菌細胞代謝的分子機制首次提出mRNA分子的存在第20頁/共255頁

1969Nirenberg（美）Holly＆Khorana尼倫伯格Nirenberg克拉納Khorana

霍利Holley

破譯了遺傳密碼酵母phetRNA的核苷酸序列并證明了所有tRNA三級結(jié)構的相似性第一個合成了核酸分子，并人工復制了酵母基因第21頁/共255頁

1975Temin，Baltimore(美)&

Dulbecco特明Temin巴爾的摩Baltimore發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成DNARNA腫瘤病毒）杜爾貝克Dulbecco第22頁/共255頁桑格Sanger吉爾伯特Gilbert伯格Berg1980Sanger（英）Gilbert&Berg（英）酶法核苷酸測序的設計者化學測序法的設計者DNA重組，在細菌中表達胰島素DNA重組技術的元老Sanger還由于測定了牛胰島素的一級結(jié)構而獲得1958年諾貝爾化學獎。第23頁/共255頁

1984Kohler（德）Milstein（美）Jerne（丹麥）科萊爾Kohler米爾斯坦Milstein杰尼

Jerne發(fā)展了單克隆抗體(MonoclonalAntibodiesMcAb)技術，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術第24頁/共255頁

1988麥克林托克

McClintock(美)可移動的遺傳因子（jumpinggeneormobileelement）McClintock50年代初發(fā)現(xiàn)88年獲獎第25頁/共255頁

1989奧爾特曼

Altman（加）＆切赫

Cech（美）核酶即核糖核酸質(zhì)酶（Ribozyme）的發(fā)現(xiàn)者（即某些RNA具有酶的功能）SidneyAltman

ThomasR.Cech

第26頁/共255頁

1989Bishop＆Varmus（美）正常細胞同樣帶有原癌基因

1993Roberts＆Sharp（美）斷裂基因（splittinggene）

Mullis（美）PCR儀的發(fā)明者

Smith

基因定點突變

1994Gilman＆Rodbell

發(fā)現(xiàn)G蛋白在細胞信號傳導中的作用

1995Lewis（美）、Nusslein－Volhard（德）、Wieschaus（美）

20世紀40～70年代先后獨立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因第27頁/共255頁1990.10：被譽為生命科學“阿波羅登月計劃”的人類基因組計劃（HGP）啟動。1998.5：美國科學家克里格文特創(chuàng)建的塞萊拉遺傳公司，目標是投入３億美元，到２００１年繪制出完整的人體基因組圖譜，與國際HGP展開競爭。1999.12.1：國際HGP聯(lián)合研究小組宣布，他們完整地破譯出人體第22對染色體的遺傳密碼。2000.3.14：當時的美國總統(tǒng)克林頓和英國首相布萊爾發(fā)表聯(lián)合聲明，呼吁將人類基因組研究成果公開，以便世界各國科學家都能自由地使用這些成果。2000.5：國際HGP完成時間預計從原定的2003年6月提前至2001年6月。2000.6.26：科學家公布人類基因組“工作框架圖”。2001.2：國際HGP(美、英、日、德、法和中國)的科學家和美國塞萊拉公司分別宣布完成繪制人類基因組測序草圖。分別在15日出版的《Nature》和16日的《Science》公布。人類基因組計劃(HumanGenomeProject)第28頁/共255頁“What’sHumanGenomeProject?”“OnebaseOnedollar!”-byataxidriver(andataxpayer)第29頁/共255頁humanArabidopsis擬南芥ThermotogamaritimaEscherichiacoli大腸桿菌Buchnerasp.APSRickettsiaprowazekiiUreaplasmaurealyticumBacillussubtilisDrosophilamelanogasterThermoplasmaacidophilumPlasmodiumfalciparumHelicobacterpylorimouseCaenorhabitiselegansratBorreliaburgorferiBorreliaburgorferiAquifexaeolicusNeisseriameningitidisZ2491Mycobacteriumtuberculosis全基因組已經(jīng)測序的一些生物第30頁/共255頁生物化學與分子生物學的意義

1.生物化學是各門生物科學的基礎，也是揭開生命奧秘的重要基礎。2.生物化學在工業(yè)上廣泛應用例如：食品工業(yè)中的醬油大豆蛋白曲霉水解氨基酸美拉德反應醬油啤酒生產(chǎn)：大麥芽+大米麥芽糖、葡萄糖+氨基酸啤酒酵母（7天）乙醇、糖、雙乙酰低溫發(fā)酵（20天）啤酒第31頁/共255頁生物有效物質(zhì)的提取制藥工業(yè)：鏈激酶、尿激酶、氨基酸、核甘酸（所謂基因營養(yǎng)物）、SOD、紫杉醇等。生物制品：疫苗皮革工業(yè)：角質(zhì)酶脫毛

生物化學不但為這些生產(chǎn)過程建立了科學基礎并為其技術改造創(chuàng)造了條件第32頁/共255頁與農(nóng)業(yè)方面有密切聯(lián)系

舉例作物病理研究

a.玉米大斑?。磕険p失20-40%產(chǎn)量）抗病蛋白

b.水稻白葉枯?。〒p失20-30%產(chǎn)量）奶牛產(chǎn)奶量與營養(yǎng)的關系中國奶牛一般4-5噸/年產(chǎn)國外奶牛8-10噸/年產(chǎn)食量自動化，營養(yǎng)個體化第33頁/共255頁重組DNA技術的應用第34頁/共255頁1212野生型轉(zhuǎn)基因抗真菌病的轉(zhuǎn)基因草坪草抗棉鈴蟲棉花抗蟲水稻第35頁/共255頁全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物銷售額及預測第36頁/共255頁生物工程作物防蟲（轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因西紅柿）生物制藥（轉(zhuǎn)基因動物-人血白蛋白）作物育種（轉(zhuǎn)基因水稻-抗除草劑）第37頁/共255頁Atobaccoplantexpressingthegeneforfireflyluciferase.Lightwasproducedaftertheplantwaswateredwithasolutioncontainingluciferin,thesubstrateforthelight-producingluciferaseenzyme(seeBox13–2).Don’texpectglow-in-the-darkornamentalplantsatyourlocalplantnurseryanytimesoon.Thelightisactuallyquiteweak;thisphotographrequireda24-hourexposure.Therealpoint—thatthistechnologyallowstheintroductionofnewtraitsintoplants—isneverthelesselegantlymade.煙草表達螢火蟲熒光素基因第38頁/共255頁表達抗蟲基因的西紅柿第39頁/共255頁Glyphosate-resistantsoybeanplants.ThephotographsshowtwoareasofasoybeanfieldinWisconsin.(a)Withoutglyphosatetreatment,thispartofthefieldisoverrunwithweeds.(b)Glyphosateresistantsoybeanplantsthriveintheglyphosate-treatedsectionofthefield.Glyphosatebreaksdownrapidlyintheenvironment.Agriculturaluseofengineeredplantssuchastheseproceedsonlyafterconsiderabledeliberation,balancingtheextraordinarypromiseofthetechnologywiththeneedtoselectnewtraitswithcare.Bothscienceandsocietyasawholehaveastakeinensuringthattheuseoftheresultantplantshasnoadverseimpactontheenvironmentoronhumanhealth.轉(zhuǎn)草甘膦基因大豆第40頁/共255頁Cloninginmice.Thegeneforhumangrowthhormonewasintroducedintothegenomeofthemouseontheright.Expressionofthegeneresultedintheunusuallylargesizeofthismouse.表達人生長激素的老鼠第41頁/共255頁噴灑工程菌清除石油污染美國GE公司構造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。第42頁/共255頁生化與司法鑒定司法鑒定是健全法制中的一個必需的工作環(huán)節(jié)，它包含了法律上要鑒定的一切事、屋和人。受傷與死亡現(xiàn)象中的生化

a.DNA含量隨死亡時間而下降b.心肌丁二酸脫氫酶、細胞色素氧化酶隨死亡時間而上升c.精子DNA第43頁/共255頁DNA指紋技術的應用親子鑒定（VNTR）

第44頁/共255頁親子鑒定風行意大利（幾十萬）現(xiàn)代家庭“情流感”

第45頁/共255頁

犯罪分析血液、唾液、頭發(fā)、精液和其他出現(xiàn)在犯罪現(xiàn)場的樣品成為嫌疑犯被監(jiān)禁或釋放強有力的證據(jù)誤差率在百萬分之一以下，結(jié)果非常精確。第46頁/共255頁DNA身份證DNA指紋技術讓你能擁有一張獨一無二的真正意義上的個人識別身份證。個人DNA基因身份證第47頁/共255頁第一章：生物大分子的提取、沉淀和離心分離第48頁/共255頁第一節(jié)生物大分子的提取

蛋白質(zhì)（包括酶），核酸，脂類，糖類等生物大分子的制備分四個階段：一.選擇材料和預處理二.細胞的破碎及細胞組分的分離三.提取和純化四.濃縮，干燥和保存第49頁/共255頁一.選擇材料及預處理動物，植物，微生物都可作為制備生物大分子的原材料，所選用的材料主要依據(jù)試驗目的來確定。

有效成份是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其它物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。

第50頁/共255頁1.動物組織：

選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。

脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導致原料變質(zhì)影響純度操作和制品的率。

保存：對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存。

a.冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：－10℃的冰箱內(nèi)；長期保存：－70℃低溫冰箱內(nèi)。

b.干燥：對于像腦垂體一類小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲存?zhèn)溆?；對于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長期保存。

第51頁/共255頁2.植物材料：

選材：注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關系密切。

a.提取核DNA：選用黃化苗（生長7－10天小麥，水稻），防止葉綠體DNA的干擾

b.提取RNA：根據(jù)實驗目的選用生長幼嫩組織為好。

保存：冷凍采樣后盡快放于－4℃――20℃冰箱內(nèi)。

DNA,RNA采樣后，N2速凍，至－70℃冰箱。對RNA樣，如不立即使用，冷凍保存尤為重要。第52頁/共255頁3.微生物：

選材：應注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：

a.利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短期保存

b.利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞內(nèi)酶等。需破碎菌體細胞分離，濕菌體可低溫短期保存，凍干粉可在4℃保存數(shù)月。

3.第53頁/共255頁二.確定測定方法在效成分在原材料中含量較低，純化是使其純度增高的過程，因此，提取和分離的每個步驟均要測定有效成分的含量。測定方法要專一、準確、靈敏和簡便。使用較多的測定方法有分光光度法、熒光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)測定、電泳分析等，有時可用電化學法和免疫分析法。第54頁/共255頁三.細胞的破碎1.機械破碎：(1)研磨法：

剪碎的動物組織如鼠肝、兔肝等置研缽中，用研磨棒研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用勻漿器處理，也能破碎動物細胞。細菌和植物組織的細胞破碎均可用此法。第55頁/共255頁(2)組織搗碎器法：用搗碎器(轉(zhuǎn)速8000-10000r/m)處理30-45s可將植物和動物細胞完全破碎。但是在搗碎期間必須保持低溫，搗碎的時間不易太長，以防溫度升高引起有效成分變性?，F(xiàn)在多用細胞破碎儀。(3)超聲波法：借助聲波的震動力破碎細胞壁和細胞器的有效方法。多用于微生物細胞的破碎，常采用間歇處理和降低溫度的方法進行。第56頁/共255頁(4)壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細胞的方法。用30MPa左右的壓力迫使幾十毫升細胞懸液通過一個小孔(＜細胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。(5)凍融法：將細胞置低溫下冰凍一定時間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復凍融多次，細胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎。第57頁/共255頁2.溶漲和自溶：

溶漲：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，引起細胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。例如紅血球置清水中會迅速溶脹破裂并釋放出血紅素。

自溶：細胞結(jié)構在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。應用此法時要特別小心操作，因為水解酶不僅可使細胞壁、細胞膜破壞，同時也可將某些有效成分在自溶時分解。3.化學處理：

用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性劑(如十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉)處理細胞時，可將細胞壁、細胞膜的結(jié)構部分溶解，進而使細胞釋放出各種酶類或DNA等物質(zhì)，并導致整個細胞破碎。

第58頁/共255頁4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解細菌細胞壁的功能。在用此法處理細菌細胞時，先是細胞壁消解，隨之而來的是因滲透壓差引起的細胞膜破裂，最后導致細胞完全破碎。

例如從某些細菌細胞提取質(zhì)粒DNA時，不少方法都采用了加溶菌酶(來自蛋清)破壞細胞壁的步驟。當有些細菌對溶菌酶不敏感時，可加巰基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促進細胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K來提高破壁效果。

第59頁/共255頁四.抽提1.抽提的含義：

抽提通常是指用適當?shù)娜軇┖头椒◤脑牧现邪延行С煞址蛛x出來的過程。經(jīng)過處理的原材料中的有效成分可用緩沖液、稀酸、稀堿、或有機溶劑（如丙酮、乙醇）等抽提，有時還可用蒸餾水抽提。

一般理想的抽提液應具備下述條件：對有效成分溶解度大，破壞作用?。粚﹄s質(zhì)不溶解或溶解度很?。粊碓磸V泛、價格低廉、操作安全等。第60頁/共255頁2.抽提的影響因子在抽提階段，pH值、金屬離子、溶劑的濃度和極性等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液必須考慮這些因素。（1）pH值：改變?nèi)苜|(zhì)解離狀態(tài)。對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應在偏離等電點的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液抽提。第61頁/共255頁(2)溶劑的極性和離子強度：有些生物大分子在極性大、離子強度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋白A時，用0.15mol/L甚至更高濃度的NaCl溶液，都可使其從刀豆粉中溶解出來，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時，則需用0.2mol/L蔗糖水溶液。一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關（相似相溶原理）；離子強度通過影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。降低極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。

第62頁/共255頁

提高離子強度：在水溶液中加中性鹽（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般離子強度較低的中性鹽溶液可促進蛋白溶解（鹽溶），高離子強度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，析出（鹽析）。

高離子強度使DNA溶解度增加；低離子強度使RNA溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。常用的鹽溶液是NaCl溶液，濃度以0.15mol/L為宜。但是在提取核蛋白或細胞器中的蛋白質(zhì)時，為促使蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與細胞器分離，則宜用高濃度(0.5-2.0mol/L)的鹽溶液。第63頁/共255頁(3)水解酶：細胞破裂后，許多水解酶釋放出來。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時，一旦條件適宜，就會發(fā)生反應，導致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實驗失敗。為此，必須采用加入抑制劑，調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，使這些酶喪失活性。如：提取，純化胰島素時，為阻止胰蛋白酶活化，采用68％的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸調(diào)節(jié)），在13－15℃抽提3h，可得到較高的回收率。因為68％乙醇可使胰蛋白酶暫時失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑Ca2+，酸性環(huán)境也抑制酶蛋白活性。

RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高第64頁/共255頁(4)溫度：

一般認為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0℃左右)時最穩(wěn)定。

例如：在生產(chǎn)人絨毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品時，一定要在低溫下進行。當溫度低于8℃時，從200公斤孕婦尿中可提取約100克HCG粗品(活力為160u/mg)；當溫度高于20℃時，從400公斤孕婦尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高溫下制備的HCG粗品很難進一步純化至3500u/mg，原因是高溫會使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破壞。一般提高溫度，溶解度增加，但易使大分子物質(zhì)變性失活。小分子物質(zhì)：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃第65頁/共255頁（5）攪拌：攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時容易產(chǎn)生泡沫，導致某些酶類變性失活。（6）氧化：

一般蛋白質(zhì)都含相當數(shù)量的巰基，該基團常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時，會使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸。還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白，酶失活。第66頁/共255頁（7）金屬離子：

蛋白質(zhì)的巰基還能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復合物。這些金屬離子主要來源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：①用無離子水或重蒸水配制試劑；②在配制的試劑中加入1-3mmol/L的EDTA(金屬離子絡合劑)。

（8）抽提液與抽提物的比例：

在抽提時，抽提液與抽提物的比例要適當，一般以5∶1為宜。如抽提液過多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進行。第67頁/共255頁第二節(jié)沉淀分離技術

沉淀法也稱溶解度法，其純化生物大分子的原理是根據(jù)物質(zhì)的結(jié)構差異（如蛋白質(zhì)分子表面疏水基團和親水基團比例的差異）來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)（如pH值、極性、離子強度、金屬離子等），使抽提液中有效成份的溶解度發(fā)生變化，從而達到從抽提液中分離有效成份的目的。蛋白質(zhì)和核酸在組成、結(jié)構及性質(zhì)等方面有明顯差異，所以制備這兩種大分子時，所用的試劑和操作方法也不完全相同。第68頁/共255頁一.蛋白質(zhì)的沉淀分離（一）鹽析沉淀法1.鹽析的原理

定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達到彼此分離的目的。

第69頁/共255頁18四月2023SWAU第70頁/共255頁第71頁/共255頁2.鹽的選擇：蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應用最廣的是硫酸銨。

硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質(zhì)有相當好的安定作用。硫酸銨在水中的溶解度大而溫度的影響小(25℃時溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分離效果比其他鹽好。但是用硫酸銨鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子會干擾蛋白氮的測定，故有時也要用其他鹽來進行鹽析。磷酸鉀和硫酸鈉的鹽析系數(shù)Ks較大，但由于在較低溫度下的溶解度太低,受溫度影響大，故應用不廣泛。第72頁/共255頁3.硫酸銨濃度的計算與調(diào)整方法

:

通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示(不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因為硫酸銨加入的體積很大，會改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。用硫酸銨進行鹽析時，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：（1）加入飽和溶液法要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時達100％飽和度。第73頁/共255頁(2)

加入固體鹽法要求：飽和度高，不增大溶液體積

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分別代表所需達到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時所需加進的硫酸銨克數(shù)；G,A：常數(shù)，與溫度有關。實際使用時，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃兩張表，室溫用25℃）

第74頁/共255頁第75頁/共255頁4.影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：（1）蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在25－30g/L。（2）離子強度和離子類型的影響

a.離子強度增加，溶解度下降，鹽析易發(fā)生

b.不同蛋白質(zhì)鹽析時所需離子強度不同，可采用分步鹽析，通過逐步增加離子強度，使不同蛋白分步沉淀出來

c.離子強度相同時，高價離子，半徑小的離子鹽析力強

第76頁/共255頁（3）pH的影響大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點電時，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時溶液pH值調(diào)到等電點效果最好。（4）溫度的影響

a.在低離子強度或純水中，溫度升高，溶解度增加；

b.在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。一般在室溫下進行鹽析;溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4℃進行;也有個別酶在低溫時失活，高溫有活性,如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25℃比0℃時溶解度低，更容易鹽析。

第77頁/共255頁5.鹽析時的注意事項：（1）添加的硫酸銨的純度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不斷攪拌，防止局部過濃，發(fā)生共沉淀；（2）同一溶液中欲分離幾種蛋白質(zhì)時，可采用分段鹽析的方法。鹽析通常與等電點沉淀法配合使用。（3）選擇好溫度，一般在室溫下進行；（4）蛋白濃度不易過高，一般25－30g/L；低濃度鹽析，可用離心分離；高濃度鹽析（70－80％），用過濾（因為粘度大，離心操作慢）；鹽析沉淀得到的蛋白質(zhì)含量較高，純品需經(jīng)脫鹽處理，如透析，凝膠過濾等。第78頁/共255頁（二）等電沉淀法：利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點一這特性，對蛋白質(zhì)進行分離純化的方法稱為等電點沉淀法。

第79頁/共255頁（三）有機溶劑沉淀法：作用機理：（1）降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；（2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機溶劑是乙醇和丙酮。優(yōu)點：

比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。

第80頁/共255頁缺點：有機溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度，避免變性。

有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操作時溶液的pH值應控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點附近。第81頁/共255頁注意：（1)低溫操作（2）樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。（3）樣品穩(wěn)定結(jié)構范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH，即與等電點共沉淀結(jié)合使用。（4)注意離子強度，離子種類的影響。第82頁/共255頁（四）選擇性變性沉淀法：

選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。

例如：利用加熱，改變pH或加進某些重金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去。應用此法，應對欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全面的了解。第83頁/共255頁（五）非離子多聚物沉淀法：聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細菌。沉淀機理：空間位置排斥效應。試劑溶解度大，在水中占據(jù)大部分空間，將需沉淀物相互靠近，增加碰撞機率。優(yōu)點：（1）操作條件溫和，不易引起變性；（2）具有極高的沉淀效率；（3）沉淀后多聚物容易除去。第84頁/共255頁二.核酸的提取與沉淀分離

核酸類化合物都溶于水而不溶于有機溶劑。所以核酸可用水溶液提取，而用有機溶劑沉淀法沉淀分離。從生物材料中分離出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白質(zhì)（DNP）或RNA-蛋白質(zhì)（RNP）復合物形式存在。因此，要制備初步純化的核酸時，首先要分離出DNP或RNP，再將復合物解聚，除去蛋白質(zhì)，然后通過沉淀法得到核酸。DNP

在0.14mol/L的氯化鈉溶液中，RNP的溶解度相當大，而DNP的溶解度僅為在水中溶解度的1%；當氯化鈉的濃度達到1mol/L的時候，RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。

所以常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。DNP第85頁/共255頁1.DNP/RNP復合物的解聚：主要采用加入去污劑、有機溶劑和蛋白水解酶等試劑來實現(xiàn)。去污劑：在破碎細胞的溶液中，加入適量的陰離子去污劑SDS、TritonX-100、Tween40和NP-40等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，將DNP/RNP復合物解聚，進而釋放出核酸。有機溶劑：苯酚、氯仿等是蛋白質(zhì)的變性劑。根據(jù)抽提液中蛋白質(zhì)的含量和溶劑的純度，用變性劑反復處理抽提液，直到離心后，上層水相（含核酸）和下層有機相之間的界面處無變性蛋白為止。蛋白水解酶：用此法除去復合物中的蛋白質(zhì)的操作比較溫和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E，可以避免剪切和破壞核酸。第86頁/共255頁2.多糖的消除：采用動物或植物作材料提取核酸時，動物在宰殺前饑餓12h，植物在取材前暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)的糖原和淀粉類物質(zhì)均會減少。混雜于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）可達到分離目的?；蛴玫润w積的2.5mol/L磷酸緩沖液和等體積的乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存在上層乙二醇甲醚中。第87頁/共255頁3.RNA的提?。?/p>

tRNA(約占細胞內(nèi)RNA的15%)的相對分子質(zhì)量較小，在細胞破碎以后溶解在水溶液中，濾液用酸處理，調(diào)節(jié)到pH5得到的沉淀的中可分離得到tRAN。

mRNA占細胞RNA的5%左右，很不穩(wěn)定，提取條件要嚴格控制。

rRNA約占細胞內(nèi)RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。由于RNA是基因表達過程中非常重要的生物分子，如mRNA攜帶了DNA為蛋白質(zhì)編碼的信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎之一，在分子生物學中占有重要的地位。

RNA的提取方法主要有稀鹽溶液提取和苯酚溶液提取。第88頁/共255頁稀鹽溶液提?。簩⒓毎扑橹瞥杉毎麆驖{，然后用0.14mol/L的氯化鈉溶液反復抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進一步與脫氧核糖核蛋白、蛋白質(zhì)、多糖等分離，可得RNA。苯酚溶液提?。涸诩毎扑橹瞥蓜驖{后，用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿在一定條件下振蕩一定時間，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，將RNA與蛋白質(zhì)分開。第89頁/共255頁4.DNA的提?。?/p>

從細胞中提取DNA，一般在細胞破碎后用濃鹽法提取。即用1mol/L的氯化鈉溶液從細胞勻漿中提取脫氧核糖核蛋白，再與含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)?；蛘呦纫?.14mol/L氯化鈉溶液(也可用0.1mol/LNaCl加上0.05mol/L檸檬酸代替)反復洗滌除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，經(jīng)氯仿戊醇(辛醇)或水飽和酚處理，除去蛋白質(zhì)，而得到DNA。第90頁/共255頁5.核酸的沉淀分離：核酸分離純化應維持在0-4℃的低溫度條件下，以防止核酸的變性和降解。為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性。常用的沉淀分離法有：

(1)有機溶劑沉淀法

(2)等電點沉淀法

(3)鈣鹽沉淀法

(4)選擇性溶劑沉淀法第91頁/共255頁（1）有機溶劑沉淀法：

由于核酸都不溶于有機溶劑，所以可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下來。(2)等電點沉淀法：

脫氧核糖核蛋白的等電點為pH4.2；核糖核蛋白的等電點力pH2.0-2.5；tRNA的等電點為pH5。所以將核酸提取液調(diào)節(jié)到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分別沉淀而分離。第92頁/共255頁(3)鈣鹽沉淀法：在核酸提取液中加入一定體積比(一般為1/10)的10%氯化鈣溶液，使DNA和RNA均成為鈣鹽形式，再加進1/5體積的乙醇，DNA鈣鹽即形成沉淀析出。(4)選擇性溶劑沉淀法：選擇適宜的溶劑，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀而與核酸分離，這種方法稱為選擇性溶劑沉淀法。①在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時間，使蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。②在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進入水層，而蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中被分離除去。③在DNA與RNA的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。第93頁/共255頁三.利用膜的分離技術1.透析：透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖等分開。第94頁/共255頁

影響透析速度的因素：（1）半透膜的通透性：常用的半透膜是玻璃紙或賽璐玢紙、火綿紙或其他改型的纖維素材料。（2）透析外液的更換：反復更換透析外液，增加透析速度；對流水透析，可進行初期透析；攪拌，使梯度差變得均勻，可增加透析速度。（3）溫度：溫度增加，則透析速度增加，但要注意生物活性。

（4）壓力：增加壓力可加快透析速度，如真空透析。第95頁/共255頁2.超濾：利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。原理：在外力作用下，超濾膜對大分子物質(zhì)的截留主要是篩分作用，決定截留效果的主要是膜的表面活性層上孔的大小與形狀。除了篩分作用外，膜表面、微孔內(nèi)的吸附和粒子在膜孔中的滯留也使大分子被截留。使用中最需注意的問題是濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，使超濾速度減慢，被截留物質(zhì)的Mr變小。第96頁/共255頁超濾的主要應用：濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過，從而達到濃縮的目的。

第97頁/共255頁

梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質(zhì)分子時，超濾是一種經(jīng)濟有效的方法，適用于分離相對分子質(zhì)量相差10倍以上的分子組分。在超濾過程中，雖然截留的大分子被濃縮，但濾過的溶質(zhì)分子仍保持初始的濃度。第98頁/共255頁

脫鹽／純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質(zhì)的過程。具體方法為：在溶液進行超濾的同時，不斷向溶液中補充溶劑，補充溶劑的速度與溶液濾過速度相同，使體系始終保持恒定，這種方法又稱透析超濾法。第99頁/共255頁超濾法的典型用途：

A:對蛋白質(zhì)、酶、DNA、單克隆抗體、免疫球蛋白進行濃縮和脫鹽；

B:藥物、激素分離；

C:從PCR擴增儀的DNA中去除引物；

D:去除標記的氨基酸和核苷酸；

E:HPLC樣品制備；

F:從樣品中除蛋白；

G:從生物體液、發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中純化抗生素、激素和藥物；

H:從細胞懸液、裂解液中回收生物分子；

I:對蛋白質(zhì)、酶、細胞、DNA、生物分子、抗體和免疫球蛋白進行濃縮和脫鹽；

J:哺乳動物細胞的收集；

K:清洗細胞、純化病毒、去除細胞碎片、除熱原。第100頁/共255頁第三節(jié)離心分離技術

離心技術在生物科學，特別是在生物化學和分子生物學研究領域，已得到十分廣泛的應用，離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備.

生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。第101頁/共255頁一.基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到的離心作用力“Fc”由下式定義：

Fc=m·a=m·ω2r

a：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，

m：沉降粒子的有效質(zhì)量，

ω：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，

r：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。

第102頁/共255頁⒉相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于在轉(zhuǎn)速相同的情況下，離心力會隨離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutionsperminute,簡寫成r/min,或rpm）。

22第103頁/共255頁

一般在低速離心時（轉(zhuǎn)速小于5000r/min），離心力的大小常用r/min來表示，而超速離心時則用g或×g來表示。由于離心管中從管口到旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的，所以在同樣轉(zhuǎn)速時，管口和管底所受到的離心力也有差別。例如：在某個角度轉(zhuǎn)頭中，離心管口到旋轉(zhuǎn)中心的距離為4.8cm，而離心管底到旋轉(zhuǎn)中心的距離是8.0cm，當轉(zhuǎn)速為12000r/min是，離心管口和離心管底所受到的相對離心力RCF分別是：RCF（管口）=1.118×10-5×(12000)2×4.8=7734gRCF（管底）=1.118×10-5×(12000)2×8.0=12891g

科技文獻中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFav），即離心管中點的離心力。旋轉(zhuǎn)軸340rminravrmax第104頁/共255頁

為便于進行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，Dole和Cotzias利用RCF的計算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關系的列線圖，圖式法比公式計算法方便。換算時，先在r標尺上取已知的半徑和在rpm標尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標尺上的交叉點即為相應的相對離心力數(shù)值。第105頁/共255頁⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：根據(jù)1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。若ω用2πn/60表示，則X1：離心前粒子到旋轉(zhuǎn)軸的距離。

X2：離心后粒子到旋轉(zhuǎn)軸的距離。

S：一般在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。例如，動物細胞的核糖體沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細胞及細胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術將他們彼此分開。

第106頁/共255頁⒋沉降速度（sedimentationvelocity）：對于球形顆粒

Fc=(1/6)d3(ρp?ρm)ω2X

Ff=3ηdv

當Fc=Ff時(1/6)d3(ρp?ρm)ω2X

=3ηdv

v=(1/18η)[d2(ρp?ρm)ω2X]Fc：離心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直徑；η：流體介質(zhì)的粘度；ρP：粒子的密度；ρm：介質(zhì)的密度；v：粒子移動的速度從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表達式也可表示為：

①當ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心場方向沉降。②當ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心場方向上浮。

2d第107頁/共255頁5.沉降系數(shù)與物質(zhì)相對分子質(zhì)量:

由沉降系數(shù)根據(jù)Svedberg公式可以計算出物質(zhì)的相對分子質(zhì)量：

Mr=RTS20,w/[D20,w(1-γρ)]Mr：相對分子質(zhì)量；

D20,w：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的擴散系數(shù)；

R:氣體常數(shù)；

T：絕對溫度；

S20,w：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的沉降系數(shù)；

γ：偏比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；

ρ：溶劑密度。

第108頁/共255頁6.沉降時間（sedimentationtime，Ts）:

在實際工作中，常常需要在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得積分得X2:離心轉(zhuǎn)軸至離心管底內(nèi)壁的距離；X1:離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液面之間的距離，將（t2－t1）用Ts表示：其中的

(lnXmax?lnXmin)/ω2

為一常數(shù)，稱k常數(shù)或k值。第109頁/共255頁7.K值（kfactor）:

K值是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降到離心管底的效率。也就是溶液達到澄清的一個指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K值愈小，粒子沉降到離心管底需要的時間愈短。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K值，是在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。若未達到最大轉(zhuǎn)速，可用下試計算K值：

利用此公式預估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預估的時間短一些。第110頁/共255頁二.離心機的主要構造和類型：離心機可分為工業(yè)用離心機和實驗用離心機。實驗用離心機又分為制備性離心機和分析性離心機，制備性離心機主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機一般都帶有光學系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為（用離心機中的光學系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和相對分子質(zhì)量等。分析性離心機都是超速離心機。第111頁/共255頁1.制備性離心機可分為三類:

低速離心機

:最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，最大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離?？捎盟睫D(zhuǎn)頭，角度轉(zhuǎn)頭，其轉(zhuǎn)速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等。這種離心機多用交流整流子電動機驅(qū)動，電機的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會損壞離心機。第112頁/共255頁

高速離心機：最大轉(zhuǎn)速為20000-25000rpm（r/min），最大相對離心力為89000×g，最大容量可達3升，分離形式也是固液沉降分離，通常配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0-40oC，轉(zhuǎn)速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有指針或數(shù)字顯示。通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、蛋白質(zhì)的硫酸銨沉淀物和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器(如核蛋白體)或單個分子。第113頁/共255頁第114頁/共255頁

超速離心機：大于30×103r/min，最大離心力600,000g，有驅(qū)動和速度控制系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，真空系統(tǒng)（減少摩擦）。新式的有微處理機（按編定程序運轉(zhuǎn)，自動計算速度和時間）。有40多種不同容量和性能的轉(zhuǎn)頭給用戶選擇。離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機的出現(xiàn)，使生物科學的研究領域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。第115頁/共255頁

角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4-12個裝離心管用的機制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20-40度之間，角度越大分離效果越好。優(yōu)點是具有較大的容量，且重心低，運轉(zhuǎn)平衡，壽命較長，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應”。壁效應容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對流擾亂，影響分離效果。2.轉(zhuǎn)頭⑴角式轉(zhuǎn)頭第116頁/共255頁⑵蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭有4或6個自由活動的吊桶（離心套管），當轉(zhuǎn)頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心優(yōu)點是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點是顆粒沉降距離長，離心所需時間也長。第117頁/共255頁第118頁/共255頁⑶區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個或多個扇形小室，隔板內(nèi)有導管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進液管泵入，通過這些導管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。第119頁/共255頁

沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復雜。第120頁/共255頁⑷垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管垂直放置，樣品顆粒的沉降距離短，離心所需時間也短，適用于密度梯度區(qū)帶離心，離心開始時和結(jié)束時液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。第121頁/共255頁⑸連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。

第122頁/共255頁3.離心管離心管主要用塑料和不銹鋼制成：塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：①防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。第123頁/共255頁4.分析性離心機分析性離心機使用了特殊設計的轉(zhuǎn)頭和光學檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。利用特殊配置的數(shù)據(jù)處理機自動計算s(沉降系數(shù))和Mr。主要用于生物大分子的相對分子質(zhì)量測定，估價樣品純度和檢測生物大分子構象的變化等。主要產(chǎn)品有美國Beckman公司的ModelE及日本日立公司的282型。第124頁/共255頁第125頁/共255頁三.離心分離方法的選擇1.差速離心法：

這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2-3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。第126頁/共255頁三.離心分離方法的選擇1.差速離心法：

這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2-3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。第127頁/共255頁第128頁/共255頁

此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。第129頁/共255頁2.密度梯度離心：又稱速率區(qū)帶離心法。是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠處（X2）介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20%的沉降系數(shù)差或更大）或相對分子質(zhì)量相差3倍的蛋白質(zhì)。大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。第130頁/共255頁

離心管先裝在密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶會越靠近離心管底。第131頁/共255頁

由ρP＞ρm可知S＞0