高等學(xué)校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目申請書1

PAGEPAGE5項目編號：_______高等學(xué)校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項申請書項目負(fù)責(zé)人：劉志剛項目名稱：鴨坦布蘇病毒病與病毒性腸炎二價基因工程疫苗的研制所在單位：安慶師范學(xué)院填表日期：2013-08-08安徽省教育廳2013年制申請者的承諾：我承諾對本人填寫的各項內(nèi)容的真實性負(fù)責(zé)，保證沒有知識產(chǎn)權(quán)爭議，如獲準(zhǔn)立項，我承諾以本表為約束性協(xié)議，遵守項目管理有關(guān)規(guī)定，按計劃開展研究工作，取得預(yù)期成果。項目負(fù)責(zé)人簽字：年月日填表說明一、申請書各項內(nèi)容必須實事求是，逐項認(rèn)真填寫，表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡要清楚易辨。二、學(xué)科名稱必須按照“國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13745-92《學(xué)科分類與代碼》的二級學(xué)科名稱填寫，封面編號由省教育廳填寫。三、項目名稱要確切反映申請項目的內(nèi)容，字?jǐn)?shù)最多不超過24個漢字。四、申請書須A4雙面打印一式十份。五、申請書除“簡表”外，各欄填寫不下時，請自行加頁。六、如不能按規(guī)定填寫，以形式審查不合格處理。二、申請者學(xué)習(xí)、進(jìn)修與工作簡歷類別起迄時間畢業(yè)學(xué)校畢業(yè)論文題目導(dǎo)師學(xué)歷（本科及以上）2006-2008青島農(nóng)業(yè)大學(xué)影響濰坊地區(qū)雛雞死亡率因素的調(diào)查王建琳2009-2012華中農(nóng)業(yè)大學(xué)禽流感H5亞型細(xì)胞滅活苗研究金梅林進(jìn)修起迄時間進(jìn)修單位進(jìn)修內(nèi)容成績2012年10月-至今華中農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病疫苗及診斷試劑的研制項目負(fù)責(zé)人近3年承擔(dān)的教學(xué)科研工作及取得的標(biāo)志性成果劉志剛，男，碩士學(xué)歷，1984年4月出生，漢族，安慶師范學(xué)院動物檢疫專業(yè)教師，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部微生物學(xué)國家重點實驗室客座人員，主要從事動物重大和新發(fā)傳染病及人畜共患傳染病病原基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)、分子致病機理、新型疫苗與分子診斷試劑等方面的研究。主持安慶師范學(xué)院青年基金一項；參與863、973、國家科技攻關(guān)、國家自然科學(xué)基金、國家支撐計劃、公益性行業(yè)專項等20余項科研課題。在國內(nèi)外期刊發(fā)表論文數(shù)篇。劉志剛，劉立峰，陳倫勇，金梅林等。禽流感新型疫苗研究進(jìn)展，動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34（2）99-103劉志剛，吳彥，孫青松。糞便中華支睪吸蟲蟲卵DNA的提取及PCR檢測方法的優(yōu)化，動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34（4）87-89劉志剛，孫青松，金梅林等。鴨坦布蘇病毒研究進(jìn)展,中國動物傳染病學(xué)報，2013,21(1):81-86劉志剛，吳彥，孫青松。肉雞黃肝病診療報告，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013,5（2）94-94劉志剛，姚蓉，金梅林等。鴨坦布蘇病毒最新研究進(jìn)展,第五屆(2013)中國水禽發(fā)展大會會議論文集晁行周，劉志剛，鄒忠，金梅林。鴨坦布蘇病毒XN株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析，第五屆(2013)中國水禽發(fā)展大會會議論文集胡勇，鄒忠，劉志剛，金梅林。鴨腸炎病毒研究進(jìn)展，第五屆(2013)中國水禽發(fā)展大會會議論文集劉志剛，趙蘇紅，金梅林等。禽流感H5N2亞型西藏株的分離鑒定與特性分析，中國獸醫(yī)學(xué)報（已接收）DaopingYu,QingfongZhu,ZhigangLiu,ShuyongZhang,andKaiZhao.ACaseofYangtzeFinlessporpoisediedoflobarpneumoniainfield.JournalofWildlifeDiseases(summitted)三、項目立論依據(jù)本項目研究目的、意義以及國內(nèi)外同類研究工作現(xiàn)狀（附主要參考文獻(xiàn)目錄及出處）鴨病毒性腸炎又名鴨瘟，是由鴨腸炎病毒引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、接觸性傳染病，各年齡的禽類均可發(fā)病。鴨病毒性腸炎在很多國家都有該病的報道[1]，在我國也廣泛流行。由于其傳播迅速，并且發(fā)病和死亡率高，能達(dá)50-100%，成鴨甚至在90%以上，已經(jīng)成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。當(dāng)前，主要采取免疫的方式預(yù)防此病。從世界各地分離的毒株，具有共同的免疫原性，能產(chǎn)生交叉免疫，為疫苗的研制帶來便利[2]。由于弱毒苗具有快速產(chǎn)生保護(hù)力的特點，疫情初始階段接種疫苗對控制病情也有顯著作用，應(yīng)用的鴨腸炎疫苗基本上是弱毒疫苗[3]。國內(nèi)主要有以下幾種：天然弱毒苗；鴨腸炎雞胚弱化毒細(xì)胞苗；鴨腸炎雞胚弱毒苗（C-KCE）。此外，程安春等[4]研制了鴨腸炎和鴨肝炎二聯(lián)弱毒苗。最近陳化蘭等[5]將鴨腸炎病毒基因組克隆Cosmid載體上，研制了鴨腸炎和禽流感二價基因工程疫苗。鴨的坦布蘇病是由鴨的黃病毒引起鴨的一種傳染病，其特征是發(fā)熱，減食，產(chǎn)蛋減少，腹瀉和傳染性卵巢炎。2010年春季開始，在中國東部地區(qū)的福建、山東和浙江省等省養(yǎng)鴨場集中的狹長地帶蛋鴨的產(chǎn)蛋量驟然減少，一些鴨群的產(chǎn)蛋量成直線下降超過了90%[6]。病鴨笨拙地蹣跚而行，共濟(jì)失調(diào)性，采食減少。一些病鴨會在數(shù)日內(nèi)死亡。通過對被感染的動物進(jìn)行病原的分離鑒定，中國科學(xué)院分離出了一種具有侵略性的新型黃病毒（BYD病毒）[7]，其包括黃熱病和登革熱在內(nèi)的一類病毒，成為在鴨體內(nèi)鑒別出的第一種黃病毒。這種病毒對中國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大損失，還可能給人類的生命健康造成威脅。該病具有以下幾大特點：①流行區(qū)域廣，造成損失巨大。②傳播速度快。③病程急，發(fā)病率高，但死亡率較低。東南亞是鴨的消費大國，尤其是中國。由于鴨的坦布蘇病毒和感染人的黃病毒的序列的同源性很高，目前為止我們還不能準(zhǔn)確的評估鴨的坦布蘇病毒的公共衛(wèi)生意義。人類和鴨子或鴨產(chǎn)品間的密切接觸是不可避免的。值得一提的是，還沒有有效地疫苗可以用來控制這種疾病。所以，這更給我們帶來了機遇與挑戰(zhàn)。以上兩種鴨病毒性疾病都嚴(yán)重威脅鴨養(yǎng)殖業(yè)，一旦爆發(fā)禽流感或鴨黃病毒疫情，將會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全隱患。而目前針對鴨的這三種病毒性疾病沒有特異性的治療藥物，僅僅禽流感有部分亞型有油佐劑疫苗，鴨瘟有雞胚傳代弱化活疫苗[8]，值得一提的是，黃病毒還沒有有效地疫苗可以用來控制這種疾病。在鴨養(yǎng)殖過程中，有一個不可忽視的情況就是，鴨比較膽小，容易受驚嚇，對外界環(huán)境敏感，多次免疫會給鴨帶來很嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重影響鴨的生長、免疫力下降，導(dǎo)致料肉比增高，造成經(jīng)濟(jì)損失。鴨腸炎病毒作為載體的優(yōu)勢：①鴨瘟病毒屬于α-皰疹病毒，作為一種DNA病毒,基因組長達(dá)158KB,具有很多的基因間隙和一些復(fù)制非必須基因，有很強的容納外源基因的能力[9]。②鴨瘟病毒的宿主窄，鴨是其自然宿主，所以用做載體疫苗對于人和其他家畜很安全。③鴨瘟病毒能潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)、淋巴樣組織和外周血淋巴細(xì)胞持續(xù)的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫[10]。鑒于以上優(yōu)點，構(gòu)建了鴨腸炎病毒的細(xì)菌人工染色體，利用MAGIC的方法在細(xì)菌內(nèi)快速，穩(wěn)定的重組和鴨坦布蘇病毒的E基因。研發(fā)一種安全有效地鴨腸炎病毒-坦布蘇病毒的二聯(lián)疫苗，從而保護(hù)鴨子免受這些病毒的侵害，最終達(dá)到一針防二病的效果。一針防多病的預(yù)防措施是廣大鴨養(yǎng)殖戶的理想養(yǎng)殖方式，這樣既可以較少人力物力，減少對鴨子的多次刺激帶來的應(yīng)激反應(yīng)，更重要的是能夠減少經(jīng)濟(jì)支出，提高經(jīng)濟(jì)效益，安全養(yǎng)鴨，科學(xué)養(yǎng)鴨。1.GoughRE.Laboratoryconfirmedoutbreaksofduckvirusenteritis(duckplague)intheUnitedKingdomfrom1977to1982.VetRec,1984,114(11):262-5.2.XuJ,

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2013Jan;171(1):238-41.四、項目研究內(nèi)容、工作方案1、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容以及擬解決的關(guān)鍵問題（1）構(gòu)建含有重組同源臂的BAC載體：將BAC載體插入弱毒株C-KCE基因組，構(gòu)建含有重組同源臂的BAC載體。（已完成）（2）將BAC載體插入DEV基因組：提取DEV基因組與（1）構(gòu)建的BAC載體共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，使二者發(fā)生同源重組，然后挑取含有BAC載體的病毒，鑒定其穩(wěn)定性。（已完成）（3）建立DEV的感染性克隆DEV-BAC：從鴨胚成纖維細(xì)胞提?。?）構(gòu)建的含有BAC載體的病毒的基因組，電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B-IS中，使其穩(wěn)定復(fù)制；再從DH10B-IS中提取BAC化的病毒基因組轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生感染性病毒粒子則表明建立了穩(wěn)定的DEV感染性克隆。（已完成）（4）運用MAGIC在細(xì)菌中將坦布蘇的E基因重組到C-KCE上建立修飾病毒基因組的方法：通過細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移，在I-Sce1催化和Red-gam重組酶介導(dǎo)下供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒在特定位點同源重組，獲得重組病毒。具體如下，將已誘變的目的基因克隆到pRT1質(zhì)粒上，將含供體質(zhì)粒pRT1的供體菌DH10β在Amp（100μg/ml）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；受體菌DH10B（已轉(zhuǎn)化DEV-BAC和pML300）在含有壯觀霉素（50μg/ml）、氯霉素（Cam,30μg/ml）和0.2%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)（避免重組酶表達(dá)），24小時后將受體菌用LB洗兩次，在添加0.2%鼠李糖（誘導(dǎo)Red-gam重組酶表達(dá)）的LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。供體菌和受體菌按比例混合，37℃靜置在含0.2%阿拉伯糖（0.2%Ara,誘導(dǎo)I-Sce1表達(dá)）的LB中培養(yǎng)4小時使二者接合。然后涂布Cam的固體LB培養(yǎng)基，42℃培養(yǎng)過夜。第二天隨機挑取單菌落，用PCR和測序鑒定重組克隆。基本路線如下圖。最后，用CRE-LoxP系統(tǒng)刪除BAC骨架，構(gòu)建僅含有突變基因的重組病毒。（5）建立形成不含BAC載體的DEV-E病毒的方法：將BAC-DEV-E的感染性克隆和能表達(dá)Cre位點特異性重組酶的質(zhì)粒pCre共轉(zhuǎn)染雞胚胚成纖維細(xì)胞。BAC載體兩端具有同向的loxP位點，這兩個位點在Cre的作用下發(fā)生位點特異性重組方式，刪除BAC骨架，形成不含BAC載體的更接近天然病毒的DEV-E病毒粒子。如下圖所示：（6）westernblot檢測E蛋白的表達(dá)，以及DEV和DEV-E在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)生長曲線的繪制。（7）動物實驗：DEV-E病毒分別對鴨腸炎病毒，坦布蘇病毒的免疫保護(hù)率的測定以商用的疫苗作為對照評價其效果。2、擬采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、研究路線、研究手段與關(guān)鍵技術(shù)）關(guān)鍵技術(shù)說明基于BAC克隆的基因打靶同源重組和位點特異性重組是廣泛被用于修飾BAC克隆的方法。RecA同源重組系統(tǒng)是最早為人們熟知的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)。然而，由RecA介導(dǎo)的同源重組所需同源區(qū)長達(dá)1000bp左右，操作的難度大，相對耗時費力，從而使其應(yīng)用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重組系統(tǒng)可以催化同源反應(yīng)在20-25bp的同源區(qū)間發(fā)生，同源重組效率較高（MuyrersJPetal.,2000;WagnerMetal.,2002;MuyrersJPetal.,2000a）。Red-gam系統(tǒng)與RecE/RecT類似，且重組效率更高（MuyrersJPetal.,2000b;JamsaiDetal.,2003）。至此，人們把這兩種重組技術(shù)結(jié)合起來（Red/ET）實現(xiàn)了直接以PCR產(chǎn)物作為供體分子對目的序列的打靶修飾，可以有效地對BAC克隆上的任意基因進(jìn)行點突變、插入和缺失等修飾。位點特異性重組是由位點特異性重組酶介導(dǎo)特定位點間的發(fā)生位點特異性重組。通用的系統(tǒng)有P1噬菌體的Cre-loxP系統(tǒng)（SmithGAetal.,2000），入噬菌體的Int-att系統(tǒng)（SuzukiYetal.,2005），和酵母的Flp-FRT系統(tǒng)（CherepanovPPetal.,1995）。位點特異性重組技術(shù)靶向性強、重組效率高，也是修飾BAC克隆的有效工具。這整個過程都是在細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行的，在很大程度上能避免了離體操作對大分子的損傷。2005年，LiMZetal.開發(fā)了一個有效的方法，用于同源重組方法在體內(nèi)構(gòu)建重組DNA分子——交配輔助遺傳整合克隆(MAGIC)（LiMZetal.,2005）?？尚行苑治觯?）理論上，BAC載體可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復(fù)制。近年來，很多皰疹病毒的基因組都被BAC化；Red-gam、Cre-loxP等重組系統(tǒng)也被廣泛用于修飾病毒基因，構(gòu)建各種重組病毒；因此，將BAC化技術(shù)和各種重組技術(shù)用于研究鴨腸炎病毒的毒力基因的功能具有可行性。（2）研究條件上，本課題組已經(jīng)有開展本研究所需的病毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞系；本實驗室長期從事用常規(guī)方法構(gòu)建重組偽狂犬病毒，因此，在構(gòu)建重組病毒操作的所有環(huán)節(jié)都上沒有障礙。（3）申請者在碩士期間從事過鴨腸炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和基因功能的研究，積累了培養(yǎng)病毒和提取基因組的經(jīng)驗，具備研究本課題所需的相關(guān)條件；本人一直從事分子生物學(xué)方面的研究，熟練大部分分子操作，例如基因克隆、基因突變、細(xì)胞培養(yǎng)以及病毒分離培養(yǎng)等技術(shù)。3、本項目特色與創(chuàng)新點（1）研究內(nèi)容創(chuàng)新：鴨腸炎病毒具有高致死力，但是對于鴨腸炎病毒這樣的大基因組病毒（150kb），本研究開發(fā)的DEV-BAC克隆和快速同源重組技術(shù)，是研究鴨腸炎病毒基因功能的強大工具。此外，該感染性克隆也是很有應(yīng)用前景的病毒載體，可用于表達(dá)外源抗原或有潛在治療作用的基因，用于多價疫苗的生產(chǎn)和基因治療等方面的研究。（2）研究思路和方法創(chuàng)新：本研究提出了一種新的、基于細(xì)菌接合和大腸桿菌體內(nèi)同源重組的DEV-BAC構(gòu)建技術(shù)。除了供體載體的構(gòu)建外，其它重組過程都在大腸桿菌進(jìn)行。通過細(xì)菌的接合介導(dǎo)克隆了目的片段的供體質(zhì)粒從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中，由受體菌表達(dá)的I-Sce1在靶位點切割供體和受體質(zhì)粒，然后由Red-gam重組酶介導(dǎo)供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒在特定位點同源重組，獲得重組病毒（周期大約是2周）。該方法有以下特點：①使用小的供體轉(zhuǎn)移載體克隆基因，在此載體上可以對目的基因進(jìn)行多種修飾，而不需要每次誘變都要從頭開始，減少了操作步驟。②在這個系統(tǒng)中，供體質(zhì)粒使用的是條件復(fù)制子，它在受體菌種后，不能復(fù)制，這就保證消除野生病毒的污染，高效的獲得重組病毒。③克隆效率高，本系統(tǒng)對受體菌株進(jìn)行了遺傳修飾，將稀有內(nèi)切酶I-Sce1的表達(dá)盒式插入染色體的基因組上，在Ara的誘導(dǎo)下，I-Sce1得到表達(dá)，進(jìn)一步降低野生病毒的污染，提高重組效率。4、項目年度研究計劃進(jìn)度安排總目標(biāo)：研制出鴨坦布蘇病毒病與病毒性腸炎二價基因工程疫苗，并申報新獸藥證書。2013.03-2013.05課題計劃：篩選鴨坦布蘇病毒病與病毒性腸炎二價基因工程疫苗毒株；構(gòu)建含有重組同源臂的BAC載體；將BAC載體插入DEV基因組。2013.06-2013.12課題計劃：建立DEV的感染性克隆DEV-BAC；運用MAGIC在細(xì)菌中將坦布蘇的E基因重組到C-KCE上建立修飾病毒基因組的方法；建立形成不含BAC載體的DEV-E病毒的方法。2014.01-2015.01課題計劃：westernblot檢測E蛋白的表達(dá)，以及DEV和DEV-E在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)生長曲線的繪制；動物實驗：DEVE病毒分別對鴨腸炎病毒，坦布蘇病毒的免疫保護(hù)率的測定，以商用的疫苗作為對照評價其效果。2015.02-2016.02課題計劃：疫苗臨床實驗；相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定及撰寫；申報新獸藥證書。5、預(yù)期研究成果形式、去向與效益分析（1）申報新獸藥證書一項