外源目的基因表達與調(diào)控2課件

第四節(jié)目的基因表達產(chǎn)物檢測

與分離純化一、外源目的基因表達產(chǎn)物的檢測外源目的基因的表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個階段。外源基因表達產(chǎn)物的檢測過程就是對特異性mRNA或蛋白質(zhì)的檢測。特異性mRNA的檢測:Northern雜交特異性蛋白質(zhì)的檢測:ELISA,Western雜交1.Northern印跡雜交(Northernblot)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的區(qū)別靶核酸：RNARNA電泳:在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。轉(zhuǎn)膜：不需變性2.ELISA1971年瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）。

ELISA原理圖YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）ELISA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法：直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原—抗體復合物，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖a間接法：是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合物后，再以酶標二抗和復合物結合，通過測定酶反應產(chǎn)物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結合情況，進而計算出抗原或抗體的量。見圖b夾心法：是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物；也可以象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結合，形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物，見圖C。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。ELISA基本的實驗過程3.WesternBlot

要檢測一個基因的表達產(chǎn)物是否正確，或者比較表達產(chǎn)物量的相對變化，首選方法是WesternBlot。Westernblot是生物學、生物化學、分子生物學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。Westernblot整個過程主要包括：PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及蛋白檢測3個階段。聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點組成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉(亞甲基)雙丙烯酰胺(Bis)聚合而成。聚合：單獨或混合時穩(wěn)定，出現(xiàn)自由基團時會聚合。化學法的引發(fā)劑：過硫酸銨（APSorAP)，催化劑：四甲基乙二胺（TEMED)

特點：凝膠濃度越大，交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小。故根據(jù)分離蛋白質(zhì)的大小選擇不同濃度的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的原理

WesternBlot基本原理

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測特定蛋白質(zhì)的表達情況。Westernblot基本原理

Figure1A.Inthedirectdetectionmethod,labeledprimaryantibodybindstoantigenonthemembraneandreactswithsubstrate,creatingadetectablesignal.1B.Intheindirectdetectionmethod,unlabeledprimaryantibodybindstotheantigen.Then,alabeledsecondaryantibodybindstotheprimaryantibodyandreactswiththesubstrate.A.DirectDetectionB.IndirectDetectionGelelectrophoresisTips:Separateproteinsbygelelectrophoresis

1-Dgels2-DgelsTransfer(WettanktransfersystemandSemi-drytransfersystem)二、外源基因表達產(chǎn)物的分離純化

（一）細胞收集

1.離心法收集細胞2.過濾法收集細胞3.絮凝法收集細胞變性劑裂解法：SDS超聲波破碎法：將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過液體介質(zhì)(如水)而變成一個個密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細胞等物質(zhì)的作用(俗稱“空化效應”)。機械破碎法：液氮凍干細胞再研磨，高壓勻漿器細胞漿液通過止逆閥進入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，