第十五章：免疫細(xì)胞標(biāo)志和功能檢測技術(shù)培訓(xùn)課件

第十五章

免疫細(xì)胞標(biāo)志和功能檢測技術(shù)

目錄第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離第二節(jié)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞的表面標(biāo)志第四節(jié)淋巴細(xì)胞的功能檢測第五節(jié)其它免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)第六節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床應(yīng)用第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離重點提示外周血單個核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞的分離T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離細(xì)胞分選和基本原理細(xì)胞分選和基本原理不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同不同細(xì)胞表面分化抗原不同白細(xì)胞分離-自然沉降法白細(xì)胞分離-自然沉降法外周靜脈血，靜置，血液分3層:上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白色層為白細(xì)胞和血小板。

白細(xì)胞分離-高分子聚合物沉降法

1.明膠沉降法

2.右旋糖酐法紅細(xì)胞凝集沉降不同細(xì)胞密度不同人的紅細(xì)胞密度為1.093粒細(xì)胞密度為1.092單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.076-1.090細(xì)胞密度血小板1.030～1.035淋巴細(xì)胞1.075～1.090粒細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離密度梯度離心(Ficoll)離心細(xì)胞表面分化抗原（CD抗原）適用于T、B細(xì)胞的分離已知CD抗原細(xì)胞亞群的分離未知CD抗原細(xì)胞亞群的分離（陰性分選）不同細(xì)胞譜系，不同細(xì)胞分化階段，細(xì)胞表面CD抗原不同磁珠大小可以選擇免疫磁珠法細(xì)胞分選過程免疫磁珠法細(xì)胞分選過程熒光激活細(xì)胞分離儀分離法E花環(huán)分離法E花環(huán)分離法CD2綿羊紅細(xì)胞受體尼龍棉柱分離法尼龍棉柱分離法PBMCB細(xì)胞、單核細(xì)胞T細(xì)胞補(bǔ)體細(xì)胞毒法利用免疫細(xì)胞表面的某種抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，加入補(bǔ)體，借助補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，將擬剔除的抗原陽性細(xì)胞破壞，收集未被破壞的抗原陰性細(xì)胞而達(dá)到免疫細(xì)胞分離的目的。

親和板結(jié)合分離法利用免疫細(xì)胞表面的某種抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，加入補(bǔ)體，借助補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，將擬剔除的抗原陽性細(xì)胞破壞，收集未被破壞的抗原陰性細(xì)胞而達(dá)到免疫細(xì)胞分離的目的。

親和板結(jié)合分離法第二節(jié)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類

一、Ｔ細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性Ｔ細(xì)胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細(xì)胞毒性Ｔ細(xì)胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、B細(xì)胞表面標(biāo)志

CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。以CD5為標(biāo)志結(jié)合CD19或CD20可將B細(xì)胞分為B1（CD19+CD5+）和B2(CD19+CD5-)兩個亞群。三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志

NK細(xì)胞表面至少存在CD2、CD16、CD56、CD69、CD94、CD96、CD158a、CD159a、CD161和CD244等多種抗原。目前多以CD3-、CD16+、CD56+作為NK細(xì)胞的典型標(biāo)志。第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原提呈細(xì)胞的表面標(biāo)志

單核-吞噬細(xì)胞的典型的表面標(biāo)志是CD14。人成熟DC的主要特征表面標(biāo)志為CD1a、CD11c和CD83，但不表達(dá)單核-吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的典型的表面標(biāo)志。第四節(jié)淋巴細(xì)胞的功能檢測T淋巴細(xì)胞增殖試驗原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大核染色質(zhì)疏松核仁明顯2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：PHA------T細(xì)胞ConA-------T細(xì)胞PWM-------T、B細(xì)胞LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

一、形態(tài)學(xué)法3H-TdR摻入法SI（刺激指數(shù)）=PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值MTT比色法淋巴細(xì)胞增殖時，攝取MTT，MTT被線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，其生成量與細(xì)胞增殖水平呈正相關(guān)。SI=試驗孔A570nm均值/對照孔A570nm均值抗原特異性T細(xì)胞增殖試驗可溶性抗原肽-MHC四聚體復(fù)合物法MHC-肽四聚體技術(shù)抗原特異性T細(xì)胞增殖試驗可溶性抗原肽-MHC四聚體復(fù)合物法MHC-肽四聚體技術(shù)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗1.形態(tài)學(xué)檢查法

待檢T細(xì)胞與相應(yīng)的靶細(xì)胞混合共育后，以瑞氏染液染色，用顯微鏡計數(shù)未被破壞的腫瘤細(xì)胞數(shù)，判斷效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力。

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗2.51Cr釋放法

體內(nèi)試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗第五節(jié)其它免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)一、趨化功能檢測1．瓊脂糖平板法

趨化指數(shù)=A’/B’A’B’2.濾膜滲透法（Boyden小室法）二、白細(xì)胞吞噬功能的檢測三、殺菌能力的檢測白細(xì)胞＋菌液37℃培養(yǎng)定時取定量菌液培養(yǎng)計算菌落數(shù)四、氮唑藍(lán)(NBT)還原試驗中性粒細(xì)胞殺菌時耗氧量增加葡萄糖6-磷酸→戊糖↑原理：NBT→藍(lán)黑色甲臜顆粒磷酸乙糖旁路代謝活力增強(qiáng)H+↑操作抗凝血+NBT應(yīng)用液溫育推片瑞士復(fù)染五、巨噬細(xì)胞功能檢測(一)炭粒廓清試驗正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。(二)吞噬功能檢測巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。

第六節(jié)免疫細(xì)胞功能檢測的臨床應(yīng)用反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測。組織器官移植后對受者的細(xì)胞免疫學(xué)功能監(jiān)測則有利于排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時采取有效措施。本章小結(jié)淋巴細(xì)胞并不是功能單一的群體，但其在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)基本是一樣的，因此要對其進(jìn)行進(jìn)一步的分類和觀察就不能采用形態(tài)學(xué)的方法，而要依靠對其表面標(biāo)志的檢測。利用細(xì)胞表面標(biāo)志可以實現(xiàn)對各類細(xì)胞的計數(shù)。本章小結(jié)免疫細(xì)胞功能試驗