六淀粉樣變的診斷和分型進(jìn)展李劍講解

基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的淀粉樣變分型方法李劍北京協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科lijian@淀粉樣變是一種機(jī)制尚不明的系統(tǒng)性疾病致淀粉樣蛋白:具有反向平行的折疊二級結(jié)構(gòu)伴侶蛋白共沉積SAP蛋白ApoE蛋白ApoA-IV蛋白沉積效應(yīng)直接細(xì)胞毒作用疑診淀粉樣變的可能●非糖尿病性腎病綜合征非缺血性的向心性肥厚的心肌病不明原因肝大或者膽管酶增高周圍或自主神經(jīng)病變不可解釋的面部或頸部瘀斑或出血巨舌如何診斷?病理學(xué)診斷組織活檢中發(fā)現(xiàn)均質(zhì)粉染物質(zhì)活檢部位陽性率60%腹壁皮下脂肪70%唇腺50%舌體>80%受累器官(腎-肝-心>90%識別剛果紅:熒光vs偏振光淀粉樣變的類型多樣:剛果紅染色陽性不夠AL輕鏈克隆性漿細(xì)胞化療/ASCTAAASSAATTRAFibαAApoA1載脂蛋白A1肝臟/β2微球蛋白-間斷血濾非AL型并不少見英國注冊登記研究Mayo診所的腎臟淀粉樣變亞型分布情況,%AL型vs.M蛋白●有M蛋白+是否就是AL型淀粉樣變?●ALM蛋白ALM蛋白血免疫固定電泳(S-IFE尿免疫固定電泳(U-IFE血清游離輕鏈比(FLCR1個陽性N=133ALM蛋白+AL型心臟淀粉樣變性n=143ATTR(57%ALSPEP/IFE/U-IFE+n=76ALn=20FLCR+n=61ALn=53ATTRn=8組織內(nèi)淀粉樣變蛋白的鑒定方法免疫組化法/(IHC●免疫電鏡熒光法DNA測序質(zhì)譜法新鮮組織全蛋白質(zhì)譜激光顯微切割+質(zhì)譜●假陰性率高AL121例有陽性組化結(jié)果商品化抗體種類少抗體質(zhì)量影響●-缺乏主導(dǎo)蛋白組織泛染,κ-λ均陽性標(biāo)本處理過程中蛋白雜質(zhì)污染AL直接顯示全部蛋白構(gòu)成,無需逐一檢測各種致病性蛋白蛋白鑒定不受構(gòu)象變化影響鑒定突變型蛋白不依賴于基因檢測利于發(fā)現(xiàn)新的致病蛋白種類激光顯微切割聯(lián)合質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)(LMD/MS微量蛋白提取LMD/MS鑒定亞型有著高特異性和敏感性N部位敏感性特異性備注113神經(jīng)100%100%部分為IHC分型失敗病例241心臟98%100%IHC42%321100%NAIHC10ATTRLMD/MS分型結(jié)果與基因檢測完全相符412796%NA大部分為IHC失敗的病例;發(fā)現(xiàn)了新亞型ALect2福爾馬林固定后的石蠟包埋組織回顧性分析●顯微切割準(zhǔn)確定位出淀粉樣變物質(zhì)沉積區(qū)實現(xiàn)病變與正常組織的準(zhǔn)確分離LMD/MS的方法學(xué)優(yōu)化蛋白提取質(zhì)譜前處理質(zhì)譜結(jié)果分析●微濾膜使用●emPAI定量蛋白●P積分&D積分的設(shè)定1.5h2.5h2h最佳蛋白提取液的確定最佳蛋白提取液的確定:0.2%Zwittergent肽段數(shù)蛋白數(shù)譜圖數(shù)2種肽段的蛋白數(shù)總的蛋白豐度平均蛋白豐度質(zhì)譜結(jié)果的解讀:利用P積分確定是否為淀粉樣變●P-score(%=Σ(emPAIamyloid×100Σ(emPAItotal●Σ(emPAI=emPAI+amyloid●Σ(emPAI=emPAItotal20vs18例正常對照標(biāo)本?P積分>=5.0:100%;83.3%質(zhì)譜結(jié)果的解讀:利用D積分確定是否為何種淀粉樣變●D-score=emPAI1st–emPAI2ndemPAI1st●emPAI=1st●emPAI=2ndD積分=0.32~0.93?D積分>=0.3可以確定出豐度最高的致淀粉樣變蛋白的致病蛋白PUMCH的LMD/MS研究●2000年1月至2014年6月期間我院確診的138例系統(tǒng)性淀粉樣變患者有器官腫大和(或器官功能不全的臨床表現(xiàn)組織活檢可見粉染無定形物質(zhì)沉積,剛果紅染色陽性●P積分>=5.0&D積分>=0.3確定亞型分型組織類型(n=138分型組織涉及各個臟器具體分型結(jié)果84例分型不確定外91%輕鏈型淀粉樣變最為常見性類型脂肪組織是最為容易分型失敗的組織類型LMD-MS問題????剛果紅染色陰性否定淀粉樣變?LMD/MSLMD/MS1AL-κAL-κ2AL-λAL-λ3ATTRATTR4AL-κAL-κ5AApoA-II-6AL-κ-7ATTR-8AL-λAL-λ9AL-κAL-κ新鮮標(biāo)本的質(zhì)譜蛋白質(zhì)學(xué)分析:Mayo的脂肪抽吸物研究剛果紅染色N=95陽性有典型的臨床表現(xiàn)N=43陰性N=52陰性(真無典型臨床表現(xiàn)N=32陰性(假有典型臨床表現(xiàn),其他部位活檢證實為淀粉樣變N=20標(biāo)本(n=75MS+MS-CRS+(n=43376CSR-(N=32131MS診斷的敏感性88%,特異性96%蛋白提取-MS分析腹壁脂肪抽吸涂片-剛果紅染色新鮮標(biāo)本的MS:Mayo的脂肪抽吸物研究CRS+vsCRS-患者的MS譜●3種伴侶蛋白的含量明顯高于CRS陰性組2/3+致淀粉樣變蛋白→→診斷淀粉樣變●20個CRS假陰性的患者●13/20MS可以檢測到典型的蛋白組成(微量-顯微鏡不能檢測到的淀粉樣變沉積物MS:(MS譜包括伴侶蛋白+致病蛋白陰性對照(正常心肌組織陽性性對照(剛果紅染色+質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測淀粉樣變女,47y,15m活動性氣短,3級●Echo:室間隔增厚,EF45%,●FLC-R:<6.5/97,Lambda+●cTnI0.35;proBNP4687●24hUP1.32g●ALP正常腹壁脂肪-直腸-齒齦活檢均陰性心肌活檢光鏡(-;剛果紅陰性●?MS結(jié)果符合淀粉樣變ApoE,ApoA-IV,SAP3種伴侶蛋白lambda鏈?P積分=14.6?D積分=0.79電鏡結(jié)果支持淀粉樣變原發(fā)性輕鏈型(lambda鏈淀粉樣變(Ma