顯微標(biāo)本制作技術(shù)

顯微標(biāo)本制作技術(shù)第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六一、實驗原理顯微標(biāo)本的制作技術(shù)是組織學(xué)，胚胎學(xué)，生理學(xué)及細(xì)胞學(xué)等學(xué)科研究觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要方法。大多數(shù)的生物材料，在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因為材料較厚，光線不易透過，以致不易看清其結(jié)構(gòu)，另外細(xì)胞內(nèi)的各個結(jié)構(gòu)，由于其折射率相差很小，即使光線可透過，也難以辯明。但在經(jīng)過固定，脫水，透明，包埋等手續(xù)后就可把材料切成較薄的片子，再用不同的染色方法就可以顯示不同細(xì)胞組織的形態(tài)及其中某些化學(xué)成份含量的變化，就可以在顯微鏡下清楚的看到其中不同的區(qū)域組分狀態(tài)，切片也便于保存，所以是教學(xué)和科研中常用的方法。第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六二、實驗方法生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類：非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等。切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。顯微制片技術(shù)雖是生物學(xué)中很基本的操作技術(shù)，但由于生物材料的個體差異，化學(xué)試劑的多樣性，因此操作技術(shù)相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，不斷總結(jié)經(jīng)驗，才能得到較好的結(jié)果。第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六即不用切片機(jī)，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞，涂片法，壓片法彌補了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標(biāo)本制備的中常用的手段。1.1涂片法主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。1、非切片法第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六1.2鋪片法主要用于動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。如:洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。1.3壓片法一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進(jìn)行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六1.4離析法該方法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解，使細(xì)胞能分散成單個個體。經(jīng)染色，脫水，透明即可觀察其個體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。1.5磨片(Groundsection)

用于很堅硬的組織，如骨和牙。第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2、切片法切片法是必須依靠手或切片機(jī)將組織切成薄片來進(jìn)行觀察的方法，為了能清晰地觀察到動、植物的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標(biāo)本。下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標(biāo)本的制備方法。第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.1取材根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。所采集材料應(yīng)立即放入固定劑，并編號，注明采集時間、地點、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng)，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.1.1動物的麻醉和殺死從活的動物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因為在不施加麻醉的情況下，有的動物會收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會騷動(如蛙、鼠)，使我們無法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細(xì)胞學(xué)方面的研究對材料的新鮮程度要求更嚴(yán)。因此，要割取生活著的動物組織，在一般情況下，就要對動物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)為原則。第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

若是一般的組織學(xué)制片，要求不太嚴(yán)格的話則可將動物先殺死然后速取其組織進(jìn)行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

上述動物若需麻醉后取材，則可用脫脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于動物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動物(狗、猴等)應(yīng)用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉．劑量一般為每kg動物體重用1g。麻醉后的動物也需放血后進(jìn)行取材固定。昆蟲等小動物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要殺死，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中。

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2.1.2動物組織塊的切割割取動物組織塊時，需注意以下幾點：第一，要考慮所取的材料應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)或全部結(jié)構(gòu)，如消化管就應(yīng)包括粘膜、粘膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)。若所取的器官太大，不易全部制片時，則可切取能代表該器官的部分材料，如狗的腎臟，可切取包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂的一部分為材料。第二，應(yīng)注意切割方向．如在管狀器官(腸等)取材時，一般是取其橫切面制片，但要觀察小腸的環(huán)行皺壁時，就應(yīng)取其縱切面制片。第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

第三，組織塊必須切得小而薄。細(xì)胞學(xué)制片的組織塊不能超過2mm，一般組織塊的大小以0.5*0.5*0.2cm為宜，柔軟組織不易切小,可先取稍大的組織塊固定2-3h。等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.2固定割取組織塊后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。固定是制片極為關(guān)鍵的一個步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。

2.2.1固定的意義新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六固定的目的和作用在于：①防止組織自溶和腐?。虎谑辜?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；③因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色；④固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。

第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.2.2固定的方法固定有物理方法和化學(xué)方法兩種。物理方法固定有干燥、高熱和低溫騾冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細(xì)菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學(xué)反應(yīng)的制片是以低溫騾冷固定作冰凍切片的?；瘜W(xué)方法固定就是用化學(xué)試劑配制成固定液使之固定。第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.2.3固定液的選擇固定液的種類很多?？煞譃閮纱箢悾汉唵喂潭ㄒ汉突旌瞎潭ㄒ?。簡單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學(xué)試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對細(xì)胞的某種成分固定得較好；不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無水乙醇可固定糖原等，單純固定液是有局限性的。

混合固定液就是用幾種化學(xué)藥品，按一定的比例混合配制而成的，由于各種藥品的優(yōu)缺點互相彌補，因此可產(chǎn)生較好的效果。第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.2.4常用的固定液福爾馬林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液）是植物制片技術(shù)中較為良好的固定液和保存液。除單細(xì)胞和絲狀藻類外，均可用此液固定．也通用于昆蟲和甲殼類的固定。

FAA液配方：福爾馬林5m1

冰醋酸5m150％或70％酒精90m1第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Bouin氏液是常用的良好固定液，廣泛應(yīng)用于一般動物組織、昆蟲組織、無脊椎動物的卵和幼蟲，以及胚胎學(xué)材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。

Bouin氏液配方：苦味酸飽和水溶液75份福爾馬林25份冰醋酸5份此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動物組織固定12—24h，小塊組織數(shù)小時即可。固定后直接入70％酒精中洗去黃色，但留一點黃色對染色并無妨礙。植物材料的固定時間為12—48h。第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.2.5固定的注意事項

(1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預(yù)先準(zhǔn)備好的固定液中進(jìn)行固定，切勿耽誤。

(2)材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液的比例為1:20。

(3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。

(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。

(5)含有氣泡的材料投入團(tuán)定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動幾次。也小用抽氣裝置進(jìn)行抽氣。第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六(6)固定時，要防止材料變形。(7)外有被膜，而內(nèi)部站構(gòu)又極易松散的器官，應(yīng)將整個器官投入固定液2—2h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈后．再行固定。(9)材料投入固定液后．須經(jīng)常搖晃。(10)容器外需貼標(biāo)簽。第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.3脫水脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進(jìn)行梯度脫水，脫水的時間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。脫水的過程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%

脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大進(jìn)行，否則將引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時，應(yīng)保證試劑的純度。第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.4透明透明是用一種即能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個有利的條件。現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。其過程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點，其缺點是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.5滲蠟將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包理與切片。石蠟有液態(tài)與固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60°c）中進(jìn)行，以保證石蠟處于液態(tài)中。第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.6包埋樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片，前邊的步驟看來既無高深的理論，又無復(fù)雜的技術(shù)，一切看似簡單，但一步做不到都會造成整個制片的前功盡棄。第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六我們可以看到：①水和酒精可以相溶。②酒精和二甲苯相溶。③二甲苯和石蠟可以相溶。因為以上相鄰步驟所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細(xì)小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也就切不成良好的切片。第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.7切片修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動切片機(jī)，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺上展平，烘干。

第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

2.8.1染料、染色液染料必須具備兩個條件：①要具有顏色②和被染物體之間具有親和力。如果只有顏色而與被染物體之間無親和力，那只能是顏料或合色物質(zhì)，而不是染料。染料的顏色和親和力都是由分子結(jié)構(gòu)決定的，即由產(chǎn)生顏色的發(fā)色團(tuán)和與組織產(chǎn)生親和力的助色團(tuán)所決定。發(fā)色團(tuán)：能使染料分子產(chǎn)生顏色的原子團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)，也就是能吸收一定波長的光線并因之而呈現(xiàn)顏色的化學(xué)結(jié)構(gòu)。助色團(tuán)：能使染料對織物纖維或組織成分產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)稱為助色團(tuán)，也就是使化合物具有成鹽性質(zhì)的原子團(tuán)。

2.8染色第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.8.2染色劑的分類

2.8.2.1根據(jù)來源分

(l)天然染色劑此類染色劑是從動、植物體中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍(lán)等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。

(2)合成染色劑全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構(gòu)成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。除上述兩類外，在生物染色中還使用一些無機(jī)化合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.8.2.2根據(jù)用途分

(l)細(xì)胞核染色劑用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。

(2)細(xì)胞質(zhì)染色劑用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。（3）脂質(zhì)染色劑用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

2.8.2.3根據(jù)染色劑的化學(xué)性質(zhì)分堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構(gòu)成的鹽類。堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)別，就在于染色劑的主要有色部分是陽離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽離子為堿性染色劑．若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

2.8.2染色原理有關(guān)染色的理論至今是一個并末完全清楚的很復(fù)雜的問題。目前一般還是從物理和化學(xué)的作用來解釋各種組織或細(xì)胞的染色現(xiàn)象。

2.8.2.1染色的物理作用此理論認(rèn)為組織細(xì)胞的染色是以物理作用為基礎(chǔ)的，主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，使染色劑進(jìn)入組織或細(xì)胞內(nèi)。

(1)毛細(xì)管作用及滲透作用但染色劑與組織細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合

(2)吸收作用又稱溶解學(xué)說。這種學(xué)說認(rèn)為組織細(xì)胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，作牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同，但不一定和干燥染色劑的顏色相同。第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

例如，品紅溶液為紅色，所染組織也為紅色，而干燥的品紅則為綠色。蘇丹類染色劑使脂質(zhì)著色，是一種溶解現(xiàn)象。因為蘇丹類染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度。當(dāng)蘇丹類的酒精溶液與組織細(xì)胞中的脂質(zhì)接觸時染色劑就從酒精中溶解到脂質(zhì)中，從而使其著色。

(3)吸附作用吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自身的特性。細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

2.8.2.2染色的化學(xué)作用化學(xué)作用的主要理論根據(jù)是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動、植物的細(xì)胞內(nèi)—般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當(dāng)堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時，就能與細(xì)胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當(dāng)酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時，就能與細(xì)胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合。例如，細(xì)胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分．故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強(qiáng)，易于著色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(曙紅)的親和力很大，易于著色。第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

所以，在蘇木精—曙紅(H．E．)染色中，細(xì)胞核被堿性染色劑蘇木精所染，細(xì)胞質(zhì)被酸性染色劑曙紅所染。這也就是細(xì)胞核是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)是嗜酸性的。除染色質(zhì)外，粘液和軟骨的基質(zhì)等都是嗜堿性的，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含的某些顆粒也為嗜酸性。須注意的是嗜堿性和嗜酸性是相對而不是絕對的，若細(xì)胞在堿性染色劑溶液中停留過久，則細(xì)胞質(zhì)也可染上堿性染色劑的顏色。某些細(xì)胞(如血細(xì)胞）具有特殊性質(zhì)，能和中性染色劑發(fā)生親和力而結(jié)合。由此可見，細(xì)胞各成分的染色強(qiáng)弱是與細(xì)胞成分及染色劑的性質(zhì)有密切關(guān)系：兩者之間的親和力強(qiáng)，染色就深；親和力弱或無，染色也就淺或無。但是，染色的實際情況是極為復(fù)雜的，組織細(xì)胞的染色作用，還隨所用溶液的pH值而變動。第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.8.3染色劑和染色液的配制

Deiafield氏蘇木精

Deiafield氏蘇木精配方蘇木精4g

無水酒精25ml10％銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液400m1

配制時先將蘇木精溶于無水酒精，待先全溶解后加入10％銨明礬水溶液，充分?jǐn)噭踊旌虾螅⑷爰?xì)口瓶內(nèi)，瓶口用紗布封住。然后