SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS現在是1頁\一共有65頁\編輯于星期一一、什么是SDS？十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體（monomer）和分子團（micellae）的混合形式存在。現在是2頁\一共有65頁\編輯于星期一SDS的作用

破壞蛋白質分子之間以及其他物質分子之間的非共價鍵，使蛋白質變性而改變原有的構象，保證蛋白質分子與SDS充分結合而形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物?，F在是3頁\一共有65頁\編輯于星期一二、SDS的基本原理（一）蛋白質分子的解聚

樣品介質和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略?，F在是4頁\一共有65頁\編輯于星期一1、SDS

陰離子去污劑

變性劑

助溶性試劑

斷裂分子內和分子間的氫鍵

分子去折疊

破壞蛋白質分子的二級和三級結構

現在是5頁\一共有65頁\編輯于星期一2、強還原劑

巰基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂?，F在是6頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是7頁\一共有65頁\編輯于星期一SDS和還原劑的作用：

（1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵

（2）氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負

電荷的蛋白質-SDS膠束。

（3）蛋白質-SDS膠束所帶的負電荷大大超

過了蛋白質分子原有的電荷量，消除

了不同分子之間原有的電荷差異?，F在是8頁\一共有65頁\編輯于星期一蛋白質-SDS膠束的特點

（1）形狀像一個長橢圓棒

（2）短軸對不同的蛋白質亞基-SDS膠束基本上是相同的。

（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比?，F在是9頁\一共有65頁\編輯于星期一膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質或亞基分子量的大小。

當蛋白質的分子量在15KD—200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系現在是10頁\一共有65頁\編輯于星期一3、影響SDS電泳的關鍵因素

（1）溶液中SDS單體濃度（>1mmol/L)

大多數蛋白質與SDS結合的重量比為1：1.4

（2）樣品緩沖液的離子強度（不>0.26)

低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。

現在是11頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）二硫鍵是否完全被還原

當二硫鍵被徹底還原后，蛋白質分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數的線性關系?，F在是12頁\一共有65頁\編輯于星期一（二）緩沖系統(tǒng)的選擇

一般情況下，在被分析的蛋白質穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質的分離和電泳的速度是非常關鍵的。

現在是13頁\一共有65頁\編輯于星期一電泳緩沖液的種類：

1、磷酸緩沖液

2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)

3、咪唑緩沖液系統(tǒng)：

比磷酸緩沖系統(tǒng)的導電性低，電泳速

度要比后者快一倍。

4、尿素系統(tǒng)：

適用分子量低于15KD的蛋白樣品。

5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)：

使用最多的緩沖液

6、Tris-硼酸鹽緩沖液：

測定糖蛋白的分子量

現在是14頁\一共有65頁\編輯于星期一（三）凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。

不同分子量范圍的蛋白質應選用不同的凝膠濃度.

現在是15頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是16頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是17頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是18頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是19頁\一共有65頁\編輯于星期一（四）分子量測定

1、相對遷移率（Rf）

Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。

測量位置應在蛋白帶的中央。

蛋白帶遷移距離

Rf=————————

溴酚藍遷移距離

現在是20頁\一共有65頁\編輯于星期一蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長度

Rf=—————————X—————————

干燥后的凝膠長度溴酚藍遷移距離

現在是21頁\一共有65頁\編輯于星期一2、作圖

以已知蛋白質分子量的常用對數值為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖現在是22頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是23頁\一共有65頁\編輯于星期一3、通過測定未知蛋白質的Rf值，便可在標

準曲線上讀出他的分子量

現在是24頁\一共有65頁\編輯于星期一三、去污劑的選擇

無離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween

Triton

陽離子去污劑：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

陰離子去污劑：SDSdeoxycholate

現在是25頁\一共有65頁\編輯于星期一四、方法

1、分類

（1）根據對樣品的處理方式的不同

還原SDS電泳

非還原SDS電泳

帶有烷基化作用的還原SDS電泳

現在是26頁\一共有65頁\編輯于星期一（2）根據緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

（3）根據電泳的形式

圓盤電泳

垂直電泳

平板電泳

水平電泳

現在是27頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是28頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是29頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是30頁\一共有65頁\編輯于星期一2、操作

（1）制備分離膠

（2）制備積層膠(堆積膠）現在是31頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是32頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是33頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是34頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是35頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是36頁\一共有65頁\編輯于星期一分離膠聚合之后現在是37頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是38頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是39頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是40頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是41頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是42頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是43頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）加樣品

樣品的處理

在蛋白溶液中加入過量的SDS后，可引起以下的反應：

蛋白質本身的電荷被屏蔽

氫鍵斷裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折疊(二級結構破壞),并形成橢球形現在是44頁\一共有65頁\編輯于星期一①還原SDS處理

當加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質被完全去折疊，只根據分子量分離。現在是45頁\一共有65頁\編輯于星期一②帶有烷基化作用的還原SDS處理

烷基化作用可以很好地并經久牢固地保護SH基團，而得到窄的電泳帶。

現在是46頁\一共有65頁\編輯于星期一③非還原的SDS處理

許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊。

現在是47頁\一共有65頁\編輯于星期一（4）電泳（5）固定

現在是48頁\一共有65頁\編輯于星期一（6）染色

考馬斯亮藍（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個SO3H基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結合在蛋白質的堿性基團上。

現在是49頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是50頁\一共有65頁\編輯于星期一②G-250

二甲花青亮藍，藍綠色。現在是51頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是52頁\一共有65頁\編輯于星期一銀染色

銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。

現在是53頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是54頁\一共有65頁\編輯于星期一（7）照相，凝膠干燥（8）定量測定

現在是55頁\一共有65頁\編輯于星期一3、電泳過程中的不正?，F象

（1）“微笑”現象

指示劑前沿呈現兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好?，F在是56頁\一共有65頁\編輯于星期一（2）“皺眉”現象

由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。

現在是57頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是58頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）“拖尾”現象

樣品溶解不佳引起。現在是59頁\一共有65頁\編輯于星期一（4）“紋理”現象

由于樣品中的不溶顆粒引起的?，F在是60頁\一共有65頁\編輯于星期一（5）偏斜現象

電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起現在是61頁\一共有65頁\編輯于星期一（6）帶太寬

加樣量太多或加樣孔泄漏引起現在是62頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是63頁\一共有65頁\編輯于星期一現在是64頁\一共有65頁\編輯于星期一MolecularmassversusmolecularweightMolecularmass(symbolm)isexpressedinDaltons(Da).OneDaltonisdefinedas1/12themassofcarbon12.MostmacromoleculesarelargeenoughtousethekiloDalton(kDa)todescribemolecularmass.Molecularweightisnotthesameasmolecularmass.Itisalsoknownasrelativemolecularmass(symbolMr,whererisasubscript).Molecularweightisdefinedastheratioofthemassofamacromoleculeto1/12themassofacarbon12atom.Itisadimensionlessquantity.WhentheliteraturegivesamassinDaorkDaitreferstomolecularmass.It