特殊顯微鏡的使用

特殊顯微鏡的使用第1頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六暗視野顯微鏡原理：暗視野顯微鏡在構(gòu)造上應(yīng)用了丁達(dá)爾現(xiàn)象，在聚光鏡中央有擋光片，不能直接觀察到照明光線，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入視野，因而視野的背景是黑的，物理的邊緣是亮點(diǎn)。視場內(nèi)被斜射光線照明，即通過樣品各種結(jié)構(gòu)表面散射和反射光線，看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓，如細(xì)胞核、線粒體和液泡等。第2頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點(diǎn)：分辨率比普通顯微鏡高50倍。缺點(diǎn)：不能辨別細(xì)微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用：在某些細(xì)菌、細(xì)菌等活體檢查中常常使用暗視野顯微鏡。常用的暗視野照明法：中心遮光法暗視野聚光法第3頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六相差顯微鏡光的三要素：波長、振幅、相位20世紀(jì)30年代初，德國物理學(xué)家澤尼克（Zernike）根據(jù)“相襯法”原理，于1932年制造出了世界上第一臺相差顯微鏡，并因此獲得1953年的諾貝爾物理學(xué)獎。第4頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六相差顯微鏡1原理：當(dāng)照明光線通過活細(xì)胞時，雖然波長及振幅沒有明顯的變化，但由于細(xì)胞的各部分及細(xì)胞與周圍介質(zhì)之間折射率有所差別，光波透過后可產(chǎn)生相位的變化。光線通過各種界面時，一部分仍為相位和振幅相同的直射光，另一部分由于光的衍射現(xiàn)象而向周圍發(fā)散成衍射光。衍射光與直射光的波長一致，但相位不同。第5頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六一般衍射光的相位比直射光推遲約1/4λ，同時到達(dá)一點(diǎn)時，兩者相互干涉，形成合成光，其強(qiáng)度取決于兩光波的振幅和相位差。在相差顯微鏡中，通過相板和環(huán)狀光闌改變衍射光或直射光的相位，將直射光和衍射光的相位差變成振幅差。如果推遲直射光的相位1/4λ，則直射光和衍射光的相位相同，發(fā)生相長干涉，合成光有2倍的振幅，樣品最為明亮，稱復(fù)反差。第6頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六如果推遲衍射光的相位1/4λ，則直射光比衍射光超前1/2λ，這時發(fā)生相消干涉，即波峰與波谷相遇，合成光比直射光暗，成正反差。一般生物樣品中各種結(jié)構(gòu)推遲光程的能力不同，但都在上述兩個極端之間，這樣就會出現(xiàn)明暗程度的不同。第7頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六步驟：1、相差顯微鏡的調(diào)試（1）光路調(diào)中：光路中心和照明光束的中心合一、聚光器調(diào)中的步驟為：1，把聚光鏡調(diào)到最高位置；2，開啟光源；3，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤，使“O”進(jìn)入標(biāo)示孔；4，低倍鏡聚焦樣品；5，縮小視野光闌，在顯微鏡的視野里可見視場光闌的模糊圖像；6，微降調(diào)聚光器使視場光闌的像清晰。第8頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六7，雙手調(diào)節(jié)聚光器的兩個調(diào)中螺桿，使視場中心移至視野中央。8，開放視場光闌，使其周邊與視野周邊相接，形成視野的內(nèi)接多邊形，如不能內(nèi)接，則重復(fù)步驟7和89，使聚光器升至頂點(diǎn)，光路調(diào)中即告完成。（2）合軸調(diào)節(jié)在設(shè)計(jì)上，相差顯微鏡的共軛面的直徑和寬度與環(huán)狀光闌與相板共軛面的透光環(huán)是一致的，使用時，每一相差顯微鏡必與環(huán)狀光闌相匹配，還要調(diào)節(jié)兩環(huán)，使其合軸。調(diào)節(jié)方法：1，從目鏡筒中拔出目鏡；第9頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六2，插入合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡，轉(zhuǎn)動望遠(yuǎn)鏡上面的螺旋，使其升降（不要從目鏡筒中拔出望遠(yuǎn)鏡），至兩環(huán)清晰為止。3，雙手輕按轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌調(diào)中螺桿并轉(zhuǎn)動，使環(huán)狀光闌移到環(huán)狀光闌與相板共軛面完全重合為止。4，如果環(huán)狀光闌的大小與相板的大小不完全一致，升降聚光器，使之一致。5，拔出望遠(yuǎn)鏡，換入目鏡后即可開始做鏡檢觀察，環(huán)狀光闌也應(yīng)做相應(yīng)轉(zhuǎn)換。第10頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六兩種不同類型的光學(xué)顯微鏡所拍攝的圖像比較第11頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六熒光顯微鏡原理：熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡可以共用一些部件（如機(jī)架等）熒光顯微鏡是利用一定波長的光(通常是紫外光或藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)出熒光，呈現(xiàn)熒光影像。熒光顯微鏡包括光源、濾片系統(tǒng)和顯微鏡三個部分。第12頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六第13頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六熒光顯微鏡

在光鏡水平上，借助于標(biāo)記熒光素或激發(fā)熒光，對細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類等組分進(jìn)行定性定位觀察。激發(fā)光源濾光片系統(tǒng):核心部件：專用的物鏡鏡頭和濾光片系統(tǒng)激發(fā)濾光片（安裝在光源和樣品之間，只允許特定波長的激光通過）阻斷濾光片（安裝在物鏡和目鏡之間，只容許熒光染料所發(fā)出的熒光通過）熒光染料DAPI特異性結(jié)合細(xì)胞中DNAGFP蛋白與編碼蛋白基因融合熒光素直接標(biāo)記技術(shù)和免疫熒