細(xì)胞衰老與凋亡

細(xì)胞衰老與凋亡第1頁/共44頁第一節(jié)細(xì)胞衰老細(xì)胞衰老又稱為老化，通常指生物發(fā)育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機(jī)能和結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變化，從而趨向死亡的不可逆現(xiàn)象。

細(xì)胞衰老的特征

細(xì)胞衰老的分子機(jī)理第2頁/共44頁一、細(xì)胞衰老的特征（一）形態(tài)變化第3頁/共44頁第4頁/共44頁二、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理（一）差錯(cuò)學(xué)派差錯(cuò)學(xué)派認(rèn)為細(xì)胞衰老是各種細(xì)胞成分在受到內(nèi)外環(huán)境的損傷作用后，因缺乏完善的修復(fù)，使“差錯(cuò)”積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老。第5頁/共44頁

代謝廢物積累學(xué)說：脂褐質(zhì)的積累大分子交聯(lián)學(xué)說：DNA交聯(lián)和膠原交聯(lián)自由基學(xué)說體細(xì)胞突變學(xué)說：突變積累和功能基因的喪失DNA損傷修復(fù)學(xué)說第6頁/共44頁（二）遺傳學(xué)派遺傳學(xué)派認(rèn)為衰老是遺傳決定的自然演進(jìn)過程，一切細(xì)胞均有內(nèi)在的預(yù)定程序決定其壽命。細(xì)胞有限分裂學(xué)說：Hayflick界限重復(fù)基因失活學(xué)說：延遲衰老衰老基因?qū)W說：衰老基因第7頁/共44頁1、細(xì)胞有限分裂學(xué)說“Hayflick”極限，即細(xì)胞最大分裂次數(shù)。L.Hayflick(1961)報(bào)道，人的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)增殖次數(shù)是有限的（60~70代）。細(xì)胞增殖次數(shù)與端粒DNA長度有關(guān)。2、重復(fù)基因失活學(xué)說：如哺乳動(dòng)物rRNA基因數(shù)隨年齡而減少。遺傳論學(xué)派第8頁/共44頁3、衰老基因?qū)W說子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)；各種動(dòng)物都有相當(dāng)恒定的平均壽命和最高壽命；成人早衰癥：平均39歲時(shí)出現(xiàn)衰老，47歲生命結(jié)束；嬰幼兒早衰癥：1歲時(shí)出現(xiàn)明顯的衰老，12~18歲生命結(jié)束，早衰癥患者體內(nèi)解旋酶發(fā)生突變。Caenrhabditiselegans的平均壽命僅3.5天，該蟲age-1單基因突變，可提高平均壽命65%，提高最大壽命110%。第9頁/共44頁Hutchinson-Gilfordsyndrome第10頁/共44頁第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的概念及生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡的特征細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第11頁/共44頁一、細(xì)胞凋亡的概念及生物學(xué)意義概念：是由一系列基因控制并受復(fù)雜信號(hào)調(diào)節(jié)的細(xì)胞自然死亡的現(xiàn)象。生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。第12頁/共44頁第13頁/共44頁二、細(xì)胞凋亡的特征

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞凋亡的生化特征第14頁/共44頁細(xì)胞凋亡和壞死的區(qū)別：第15頁/共44頁

第16頁/共44頁（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征凋亡的起始：細(xì)胞器、染色質(zhì)等開始變化凋亡小體的形成：質(zhì)膜包裹染色質(zhì)和細(xì)胞器凋亡小體的消化：被吞噬細(xì)胞消化第17頁/共44頁胸腺細(xì)胞正常凋亡第18頁/共44頁胸腺細(xì)胞正常凋亡第19頁/共44頁細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）是一種基因指導(dǎo)的細(xì)胞自我消亡方式。PCD和細(xì)胞凋亡的區(qū)別在以下方面：PCD是功能性概念，凋亡是形態(tài)學(xué)概念。PCD的最終結(jié)果是細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎發(fā)育過程中。（三）、細(xì)胞程序性死亡第20頁/共44頁線蟲Caenorhabditiselegans是研究個(gè)體發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，細(xì)胞數(shù)量少）。線蟲神經(jīng)系統(tǒng)由302個(gè)細(xì)胞組成。這些細(xì)胞來自于407個(gè)前體細(xì)胞。也就是說105個(gè)細(xì)胞發(fā)生了程序性死亡。控制線蟲細(xì)胞凋亡的基因主要有3個(gè)Ced-3、Ced-4和Ced-9Ced-3和

Ced-4的作用是誘發(fā)凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。第21頁/共44頁1ced基因

在一種無脊椎動(dòng)物——線蟲中發(fā)現(xiàn)的一組基因，共14個(gè)，其中ced-3,ced-4,ced-9研究的較為清楚。Ced-3編碼530個(gè)氨基酸，其中有100個(gè)氨基酸為絲氨酸富含區(qū)。2ICE基因

是哺乳動(dòng)物中克隆出的ced-3的同源基因，為白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)化酶（inter-leukin-1βconvertingenzyme）。是一種底物特異性半胱氨酸蛋白酶（cysteinasparticacicspecificprotease,caspase家族)，這個(gè)家族的共同點(diǎn)是特異的斷開天冬氨酸后的肽鍵.3bcl-2

從人的濾泡性B細(xì)胞淋巴瘤中分離出的與ced-9同源的抑制細(xì)胞凋亡的一組基因，位于人第9號(hào)染色體上。4rpr基因

從果蠅中分離出的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，有65個(gè)氨基酸組成。5c-myc基因

是一多功能的原癌基因，存在于核仁中，可抑制凋亡。6p53基因

腫瘤抑制基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是腫瘤生長抑制的主要原因。另外Fas/APO-1,ras,TNF,TGF-β1,RP-2,RP-8,PD-1都是已報(bào)道的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因。目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因第22頁/共44頁三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理●線蟲(C.elegans)是研究細(xì)胞凋亡的理想材料，可以直接觀察不同發(fā)育時(shí)期某些細(xì)胞群的定期死亡，現(xiàn)以發(fā)現(xiàn)10幾種與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。（→）Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡 ●Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡第23頁/共44頁（←）線蟲細(xì)胞凋亡的研究線蟲（C.elegans)是研究細(xì)胞凋亡的理想材料，提供了一個(gè)良好的模型。它蟲體透明，易于觀察。早期研究發(fā)現(xiàn)蟲體在不同發(fā)育時(shí)期某些細(xì)胞定期死亡。在整個(gè)發(fā)育過程中，有131個(gè)細(xì)胞陸續(xù)進(jìn)入死亡程序，決定這些細(xì)胞進(jìn)入死亡程序的是一系列凋亡基因。現(xiàn)已從中分離出10余個(gè)凋亡基因。正常細(xì)胞走向死亡細(xì)胞死細(xì)胞降解細(xì)胞起動(dòng)死亡程序執(zhí)行死亡程序被吞噬處理Ced-2Ces-1cgl-1Ced-9ced-3\4Ced-1\2\5ced-5\6\7ced-8\10nec-1其中研究的較清楚的是ced-9(抑制細(xì)胞凋亡）、ced-3,ced-4(促進(jìn)細(xì)胞凋亡）（→）第24頁/共44頁線蟲細(xì)胞凋亡的過程可劃分為四個(gè)階段：1命令階段（execution）這一階段決定細(xì)胞凋亡與否，通過基因ced-3和ced-4的指令可以執(zhí)行細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞有程序有步驟的凋亡，而ced-9基因則能阻止這一凋亡過程的執(zhí)行。2細(xì)胞凋亡階段（death）已經(jīng)接受凋亡指令的細(xì)胞，在這一階段將受ced-3和ced-4基因的調(diào)控而停止生長，選擇凋亡途徑。3細(xì)胞吞噬階段（engulfment）這一階段細(xì)胞處于被臨近細(xì)胞吞噬的狀態(tài)?？刂七@一過程的基因有兩組：即ced-1,ced-6,ced-7,ced-8基因組和ced-2,ced-10基因組。4分解階段（degradation）凋亡細(xì)胞被吞噬后很快分解，這一階段起作用的基因是nec-1.(←）第25頁/共44頁Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族在哺乳類找到的一組與ced-3基因同源的基因，構(gòu)成一個(gè)家族，即Caspase家族。

Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑第26頁/共44頁Caspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活則需在兩個(gè)亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割（裂解活化），結(jié)果產(chǎn)生了由兩個(gè)亞基組成的異二聚體，此即具有活性的酶。第27頁/共44頁胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑

凋亡信號(hào)通路當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡

Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;

裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。第28頁/共44頁Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3，這三個(gè)區(qū)域是調(diào)節(jié)凋亡所必需的結(jié)構(gòu)。 ◆Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡

第29頁/共44頁Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡◆當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使bcl-2裂解成2個(gè)片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡第30頁/共44頁

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)(掃描電鏡)第31頁/共44頁2002年10月7日英國人悉尼·布雷諾爾、美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，因在細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston

第32頁/共44頁第33頁/共44頁（二）細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征

◆細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180～200bp特征性的DNAladders◆凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）積累并達(dá)到較高水平第34頁/共44頁細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker（自趙允、翟中和）第35頁/共44頁三、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法◆形態(tài)學(xué)觀測(cè)：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測(cè)定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法◆彗星電泳法（cometassay）◆流式細(xì)胞分析根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA

產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。第36頁/共44頁與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對(duì)細(xì)胞凋亡的凋控。其中研究較多的有bcl-2c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。1、mycc-myc對(duì)增殖和凋亡的調(diào)節(jié)是一樣的。當(dāng)生長因子存在，bcl-2基因表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。（一）細(xì)胞凋亡相關(guān)基因第37頁/共44頁2、bcl-2細(xì)胞凋亡抑制基因，名稱來源于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/Leukemia-2，bcl-2)。bcl-2

能夠編碼

bcl-2α（26KD）和

bcl-2β（22KD）兩種蛋白質(zhì)，是膜的整合蛋白，主要存在于線粒體外膜、核膜及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。bcl-2的功能相當(dāng)于線蟲中的ced9。第38頁/共44頁3、fasfas又稱作APO-1，屬TNF受體和NGF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國際會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。第39頁/共44頁4、ICE蛋白酶家族ICE蛋白酶參與Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與線蟲細(xì)胞凋亡基因ced-3同源。ICE又稱為Caspase，能選擇性降解蛋白質(zhì)。ced-4在哺乳動(dòng)物中的同源體為Apaf-