重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則解析

重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則二OO六年十月目錄前言目的和意義適用范圍局限性宿主細胞的選擇宿主細胞來源、歷史和一般特性宿主細胞來源和歷史宿主細胞一般特性重組工程細胞克隆構(gòu)建過程、篩選及鑒定目的基因來源表達載體的具體構(gòu)建步驟載體引入宿主細胞的方法及重組工程細胞的篩選重組工程細胞的初步鑒定重組工程細胞庫的建立細胞庫建立建庫細胞的管理細胞庫檢定細胞鑒定細胞種屬的鑒定致瘤性試驗?zāi)康幕蚝捅磉_框架分析表達產(chǎn)物檢測微生物污染檢測細菌、真菌和支原體檢查病毒因子的檢查體外試驗體內(nèi)試驗種屬特異性病毒的檢定逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測感染性試驗?zāi)孓D(zhuǎn)錄酶檢測透射電鏡檢查細胞穩(wěn)定性研究貯存條件下的穩(wěn)定性傳代 /擴增過程中的穩(wěn)定性基因水平的比較目的產(chǎn)物表達水平的比較細胞自身的穩(wěn)定性內(nèi)源因子檢查致瘤性監(jiān)測生產(chǎn)過程細胞質(zhì)量控制常規(guī)生產(chǎn)過程監(jiān)控細胞增殖限度其它風(fēng)險性因素控制小結(jié)9、名詞解釋10、參考文獻6.2.36.2.3細胞自身的穩(wěn)定性1前言對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、帶有糖基化修飾基團的抗體、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳動物細胞才能正確表達和修飾成具有預(yù)期生物活性的重組制品。隨著生物工程技術(shù)的進步和發(fā)展，目前這些細胞應(yīng)用不斷增多。在宿主細胞選擇、重組工程細胞構(gòu)建以及生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)擴增和監(jiān)控過程中，不僅要關(guān)注細胞的適用性、目的產(chǎn)物表達生產(chǎn)能力，同時還應(yīng)當重視伴隨細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的內(nèi)源性病毒、 宿主細胞殘余蛋白和 DNA、致腫瘤成分等潛在的風(fēng)險性因素對重組產(chǎn)品帶來的安全性影響，在早期研究階段，同步開展庫細胞、生產(chǎn)培養(yǎng)過程細胞、生產(chǎn)終末細胞的全面檢定和控制以及病毒和 /或致瘤性成分的去除 /滅活工藝的驗證。目的和意義經(jīng)過全面檢測的種子細胞是實現(xiàn)重組基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)， 使生產(chǎn)用種子細胞具有共同的始祖細胞， 保持相同的遺傳和生物學(xué)特征，在特定的培養(yǎng)環(huán)境和條件下持續(xù)穩(wěn)定表達攜帶的外源目的基因； 經(jīng)過研究確定細胞在擴增培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中的變化，才能夠有效控制風(fēng)險性因素，滿足生產(chǎn)的持續(xù)需求，使產(chǎn)品質(zhì)量保持一致。本技術(shù)評價一般原則重在闡述重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制的基本內(nèi)容和相關(guān)要求，以期引導(dǎo)開展全面完整的細胞質(zhì)量試驗研究、生產(chǎn)細胞培養(yǎng)工藝驗證，建立系統(tǒng)規(guī)范的重組工程細胞庫及實現(xiàn)生產(chǎn)過程細胞質(zhì)量的有效監(jiān)控。適用范圍本技術(shù)評價一般原則僅適用于生產(chǎn)前述的抗體等治療用重組制品的哺乳動物細胞， 不包括細菌、 酵母等重組工程菌， 也不包括治療用體細胞、疫苗生產(chǎn)用細胞基質(zhì)、雜交瘤細胞等。 相關(guān)內(nèi)容可參見國家局已頒布的指導(dǎo)原則和藥品審評中心公布的藥品技術(shù)評價一般原則。 重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞亦須符合這些已有文件的相關(guān)要求。局限性本技術(shù)評價一般原則主要結(jié)合目前對于重組工程細胞結(jié)構(gòu)、 功能，細胞致瘤性和內(nèi)源性病毒對重組產(chǎn)品帶來的風(fēng)險及微生物污染因子的危害性共識，提出技術(shù)審評關(guān)注的重點問題和基本原則，需要結(jié)合具體細胞和實際培養(yǎng)控制條件考慮和選擇。宿主細胞的選擇應(yīng)選擇來源、背景十分清楚的適宜宿主細胞，明確存在的內(nèi)源性病毒和 /或致瘤性等影響制品安全性的因素，并結(jié)合制品純化的程度、細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中風(fēng)險性成分的去除 /滅活能力及殘留量控制水平，以及臨床應(yīng)用適應(yīng)癥和用法用量等特點綜合分析，經(jīng)利弊權(quán)衡后確定與特定制品相適應(yīng)的宿主細胞。盡可能選擇致瘤性試驗陰性和低增殖代次水平的宿主細胞。對于改良的傳代細胞、全新構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細胞，甚至腫瘤細胞等，由于前期研究、背景資料和致瘤性風(fēng)險等積累的認識十分有限，其開發(fā)應(yīng)用將引入新的安全性隱患，需要慎重權(quán)衡利弊，在開展充分研究的基礎(chǔ)上嚴格控制潛在的風(fēng)險性。宿主細胞來源、歷史和一般特性用于構(gòu)建重組工程細胞的宿主細胞其來源和培養(yǎng)歷史應(yīng)清楚，可溯源有關(guān)背景資料，例如最初分離建立株 /系的機構(gòu)，在不同機構(gòu)內(nèi)引進和傳代經(jīng)過，既往進行過的檢測分析項目和確證研究結(jié)果，細胞保存狀態(tài)，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)已達到的增殖代次 /水平及傳代過程中所用過的人源或動物源性材料等。宿主細胞來源和歷史應(yīng)提供宿主細胞來源的相關(guān)資料和證明性文件， 說明是否曾進行過遺傳操作引入了外源基因序列， 描述已進行過的研究檢定項目例如細胞鑒定、內(nèi)源和外源性因子檢測等的結(jié)果及引進時進行的復(fù)核檢定結(jié)果。宿主細胞一般特性需闡述宿主細胞的基本特征，如形態(tài)、培養(yǎng)和生長一般特征、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液要求。新構(gòu)建的細胞系應(yīng)檢測致瘤性特征。重組工程細胞克隆構(gòu)建過程、篩選及鑒定目前可采用多種表達載體、宿主細胞、基因?qū)敕椒ê秃Y選標記等進行工程細胞的構(gòu)建和篩選，構(gòu)建成功的標志是工程細胞能夠穩(wěn)定、高效地表達結(jié)構(gòu)正確且具有生物活性的目的產(chǎn)物。應(yīng)盡可能提供關(guān)于重組工程細胞構(gòu)建和鑒定的詳細資料并重點描述：目的基因來源應(yīng)包括最初獲得目的基因序列的來源和背景方面的資料，用于制備目的基因 cDNA的方法，以及必要的初步序列分析。表達載體的具體構(gòu)建步驟需說明表達載體組成成分以及主要元件的來源和功能，包括插入基因和側(cè)翼區(qū)序列、復(fù)制子、啟動子、增強子、抗性標記以及主要的酶切位點等。應(yīng)詳述表達載體構(gòu)建或改建的過程。對構(gòu)建成功的表達載體應(yīng)進行必要的鑒定，并提供相關(guān)試驗資料如構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜等。載體引入宿主細胞的方法及重組工程細胞的篩選應(yīng)詳細說明載體引入宿主細胞的方法和操作過程，重組工程細胞的篩選原理、條件和標準，以及采用何種方法增加基因拷貝數(shù)等。闡述外源基因引入宿主細胞后產(chǎn)生的變化， 符合篩選標準的候選細胞可能為多個細胞株， 但擬用于建庫的細胞株應(yīng)為經(jīng)研究比較后確定的單一細胞克隆。重組工程細胞的初步鑒定應(yīng)檢測重組后細胞基本性狀的改變， 比較研究插入外源基因后細胞致瘤性特征的改變。 應(yīng)說明表達載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài) （是否整合到染色體）并采用適宜的方法測定其拷貝數(shù)。 說明啟動和控制目的基因在宿主細胞中表達所采用的方法，并進行初步的表達產(chǎn)物鑒別和表達水平檢測。對于選定的工程細胞株應(yīng)進行充分的目的基因全序列確認，以保證用于編碼和表達目的產(chǎn)物的基因在初始核酸序列上的正確性。重組工程細胞庫的建立連續(xù)傳代細胞生產(chǎn)重組制品的最大優(yōu)點是使每批產(chǎn)品都有一個經(jīng)過檢定的共同起源細胞， 因此建立細胞庫的目的就是為了保證生產(chǎn)的可持續(xù)性和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。重組制品的生產(chǎn)必須建立在良好的細胞庫管理基礎(chǔ)上。細胞庫建立細胞庫可為三級即原始細胞庫、主細胞庫（ MCB）和工作細胞庫（ WCB）；也可采用主細胞庫和工作細胞庫組成的兩級細胞庫；在某些特殊情況下，也可使用主細胞庫一級庫。 用于建庫的初始工程細胞株應(yīng)為經(jīng)過克隆選擇而形成的均一細胞群體，必要時須經(jīng)與實際生產(chǎn)過程采用的無血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相一致的適應(yīng)性培養(yǎng)。建庫細胞的管理在制備WCB過程中不得進行單克隆篩選， 以避免由于個別基因突變引起 WCB中細胞群體性的遺傳特性改變； 為了保證細胞庫中每個容器中的內(nèi)容物完全一致，如培養(yǎng)細胞采用幾個器皿的，應(yīng)將所有培養(yǎng)皿中的細胞混合成單批后再分裝。在細胞庫的建庫期間應(yīng)采取適宜的預(yù)防措施，以確保細胞不被污染（包括微生物污染和實驗室中其他類型細胞的交叉污染等）。上述各級種子庫的細胞應(yīng)按照特定的要求經(jīng)過全面檢定合格后方可使用（具體要求參見本文細胞庫檢定）。對于細胞庫建庫的具體過程、方法和管理的要求，參見參考文獻 [1]。細胞庫檢定正確的起始細胞是實現(xiàn)良好生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。 檢定的目的是為了確認經(jīng)過初步篩選建庫的細胞符合預(yù)期設(shè)計要求， 攜帶有穩(wěn)定的目的基因，能夠持續(xù)表達有功能活性的目的產(chǎn)物， 沒有微生物污染和混雜其它細胞， 能夠直接擴增儲備或者應(yīng)用于生產(chǎn)。對于原始庫細胞和 /或主庫細胞，通常需要進行一次全面系統(tǒng)的研究檢定，包括遺傳學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)，以便從源頭開始嚴格控制起始細胞的一致性和防止污染。經(jīng)過傳代穩(wěn)定性研究的主細胞到工作細胞，只經(jīng)過簡單的傳代、擴增，可以適當簡化檢定項目，重點檢測外源因子污染和防止混入了其它細胞。保存的數(shù)目和傳代水平應(yīng)保證生產(chǎn)用細胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)。細胞鑒定細胞種屬的鑒定應(yīng)驗明細胞的種屬來源，分析細胞的同一性，排除與其它細胞的交叉污染。目前常用的方法有細胞生長特征和培養(yǎng)形態(tài)學(xué)檢查、種屬特異性抗原檢測、染色體核型分析、同工酶分析、限制性內(nèi)切酶分析、基因多態(tài)性分析等。應(yīng)結(jié)合具體細胞固有的特性進行適宜的組合和選擇，以實現(xiàn)正確鑒別為目的。致瘤性試驗應(yīng)檢測分析目的基因引入細胞后的致瘤性特征，對于陽性細胞，應(yīng)研究確定致瘤性改變對產(chǎn)品帶來的安全性風(fēng)險。目的基因和表達框架分析目的基因和表達框架的確證是種子庫細胞檢定的重要組成部分，對于表達正確的目的產(chǎn)物具有先決性意義。常用的方法包括：通過 PCR擴增樣本DNA或用從細胞基質(zhì)中分離的 RNA制備的cDNA來進行DNA序列分析；通過限制性內(nèi)切酶譜和 Southern雜交來檢測基因的完整性，確定目的基因的拷貝數(shù)，并檢測是否有任何序列插入或缺失等?；蛐蛄蟹治鲑Y料應(yīng)包括試驗方案和步驟、 原始的測序圖、 測得序列以及翻譯后的氨基酸序列， 同時應(yīng)將實際測得序列與理論序列進行對比。清楚標注兩者之間的異同。 為保證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的正確和穩(wěn)定， 基因序列分析應(yīng)貫穿于重組工程細胞的篩選和鑒定、細胞庫的建立和檢定以及生產(chǎn)細胞培養(yǎng)監(jiān)控的全過程。表達產(chǎn)物檢測應(yīng)檢測分析目的產(chǎn)物的表達量和生物活性。 活性測定應(yīng)選擇與其治療機理相對應(yīng)并能夠定量的方法。 活性測定方法學(xué)研究可貫穿于藥品研究的始終，并經(jīng)相關(guān)驗證分析。微生物污染檢測細菌、真菌和支原體檢查應(yīng)對 MCB、WCB和 EPC（生產(chǎn)終末期細胞）進行全面檢查，對生產(chǎn)培養(yǎng)過程中的細胞進行監(jiān)測。具體方法見參考文獻 [1]。在進行支原體檢查時，應(yīng)注意同時進行培養(yǎng)法和指示細胞法兩種方法。必要時可采用掃描電鏡法檢查細胞是否受到特殊微生物的污染。病毒因子的檢查包括細胞來源宿主動物潛在的內(nèi)源性病毒和由于操作帶入的外源性病毒的檢查。 對細胞進行病毒檢查的種類和方法， 應(yīng)根據(jù)細胞的種屬和組織來源、傳代歷史和細胞特性選擇。體外試驗應(yīng)將 MCB、WCB和EPC細胞活細胞或細胞裂解產(chǎn)物接種到盡可能多的病毒易感的指示細胞上。 可以根據(jù)細胞來源，傳代史和細胞培養(yǎng)基的原料使用情況來選擇適宜的指示細胞。檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。具體方法見參考文獻 [1]。體內(nèi)試驗通過接種乳鼠、成年小鼠、雞胚、豚鼠、家兔或其它敏感動物來檢測細胞培養(yǎng)物中潛伏性病毒。通常要對 MCB、EPC進行體內(nèi)試驗。具體方法見參考文獻 [1]種屬特異性病毒的檢定通過抗體產(chǎn)生試驗來檢測可能存在于 MCB細胞中的種屬特異性病毒，如嚙齒類動物來源的細胞應(yīng)進行小鼠、倉鼠或大鼠的抗體生成試驗。嚴格控制對于人類有危害的鼠源性病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒的試驗應(yīng)包括感染性試驗、逆轉(zhuǎn)錄酶 （RT）檢測和電鏡技術(shù)檢查。應(yīng)采用上述方法對 MCB和EPC細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。感染性試驗應(yīng)根據(jù)細胞的特性及可能存在的逆轉(zhuǎn)錄病毒種類選擇適宜的檢測方法，如 XC空斑試驗（ XCplaque）、延時 XC空斑試驗、 S＋L－灶點分析（ S＋L－Focus）等。試驗時應(yīng)注意設(shè)立恰當?shù)年?/陽性對照。逆轉(zhuǎn)錄酶檢測為提高檢測的敏感性， 通常需要將受試細胞經(jīng)適當?shù)幕瘜W(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后， 收集上清液分別與檢測細胞聯(lián)合培養(yǎng)， 再檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，注意設(shè)立恰當?shù)年?/陽性對照。透射電鏡檢查透射電鏡下可觀察細胞基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和病毒樣顆粒的存在，應(yīng)比較未經(jīng)和經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞。另外，需要對細胞培養(yǎng)液超速離心后所得的沉淀物經(jīng)負染后進行檢查。觀察有無逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以及顆粒的類型。上述三種方法具有不同的檢測特性和靈敏度。因此，應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時，建議進行透射電鏡檢查或感染性試驗，如果確證對人或者其它靈長類動物細胞有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，該細胞不可用于生產(chǎn)。細胞穩(wěn)定性研究應(yīng)包括庫細胞、生產(chǎn)過程中細胞、生產(chǎn)終末期和 /或超過生產(chǎn)終末期等不同培養(yǎng)時期的細胞。庫細胞應(yīng)重點考察貯存、復(fù)蘇等操作處理因素的影響和傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上確定庫細胞傳代限度；生產(chǎn)過程中細胞、生產(chǎn)終末期和 /或超過生產(chǎn)終末期細胞應(yīng)考察模擬生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)條件對細胞生長狀況、表達能力等的影響，并確定生產(chǎn)細胞增殖限度和 /或連續(xù)培養(yǎng)時間；使細胞始終能夠持續(xù)、穩(wěn)定地表達重組制品，并將對終產(chǎn)品產(chǎn)生安全性影響的風(fēng)險因素嚴格控制在最低限度。貯存條件下的穩(wěn)定性當儲存的細胞復(fù)蘇后用于生產(chǎn)制品時， 應(yīng)進行細胞存活率和功能活性等與細胞質(zhì)量密切關(guān)聯(lián)項目的研究測定， 以證實復(fù)蘇細胞表達能力的穩(wěn)定性。應(yīng)有對建庫細胞貯存條件下穩(wěn)定性監(jiān)測的方案。這種監(jiān)測應(yīng)在一支或多支冷凍保藏的 WCB復(fù)蘇后制備生產(chǎn)用細胞時進行，或當一支或多支冷凍保藏的 MCB復(fù)蘇并用于制備新 WCB時進行。如果長時間未進行生產(chǎn)時， 應(yīng)按上市申請時所述的間隔時間對生產(chǎn)用細胞庫進行活力測試。如果細胞的活力沒有明顯的減退，一般不需對 MCB或WCB作進一步檢定。傳代/擴增過程中的穩(wěn)定性應(yīng)對庫細胞和生產(chǎn)過程細胞進行傳代 /擴增的穩(wěn)定性研究，可將復(fù)蘇的庫細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至一定的代次和將工作庫細胞在模擬實際生產(chǎn)條件下連續(xù)培養(yǎng)、擴增（逐級放大擴增過程），直至預(yù)期培養(yǎng)時間以及超過預(yù)期時間之外的延長時間點，收獲后進行檢測分析。通過考察目的基因、表達框架等在重組工程細胞中的傳代穩(wěn)定性和目的產(chǎn)物表達的穩(wěn)定性， 制定庫細胞的限傳代次和生產(chǎn)細胞的增殖限度以保證實際生產(chǎn)過程中細胞整體擴增水平以及伴隨的內(nèi)源性病毒和 /或致瘤性風(fēng)險等的抑制狀態(tài)在預(yù)期限度范圍內(nèi)。至少應(yīng)包括以下方面的試驗研究：基因水平的比較目的基因編碼序列和表達框架不應(yīng)有錯誤，包括突變、缺失、插入。并注意比較基因拷貝數(shù)的變化。目的產(chǎn)物表達水平的比較目的產(chǎn)物的表達量和表達活性不應(yīng)有明顯降低，根據(jù)不同的產(chǎn)品和具體研究結(jié)果確定適宜的可接受標準。應(yīng)重點檢測細胞在傳代 /擴增過程中的形態(tài)、生長、代謝等基本狀況，遺傳特征和致腫瘤特性的變化。內(nèi)源因子檢查應(yīng)動態(tài)考察內(nèi)源因子的復(fù)制是否得到有效抑制。 重點檢測由細胞來源動物和宿主細胞特性所決定的易染病毒如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒， 分析其對于人類的致病性和重要性，嚴格控制其產(chǎn)生的條件。致瘤性監(jiān)測對于致瘤性試驗陽性的細胞，應(yīng)通過比較研究考察細胞培養(yǎng)傳代過程中致瘤性特征的改變，例如試驗陽性時的細胞代次、最低接種量、腫瘤轉(zhuǎn)移擴散、腫瘤增殖時間、瘤組織病理特征等。生產(chǎn)過程細胞質(zhì)量控制種子庫細胞應(yīng)在全面質(zhì)量研究和檢測分析基礎(chǔ)上，模擬實際生產(chǎn)過程進行擴增培養(yǎng)，并檢測分析目的基因表達的穩(wěn)定性、細胞生長狀況、污染控制、致腫瘤風(fēng)險性等；規(guī)?；a(chǎn)后須建立細胞生產(chǎn)培養(yǎng)過程的監(jiān)控標準，產(chǎn)品生產(chǎn)細胞培養(yǎng)終末期應(yīng)符合質(zhì)量控制相關(guān)要求。對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和 /或致瘤性試驗陽性的細胞，應(yīng)依據(jù)工藝處理能力制定風(fēng)險性成分的控制條件，并根據(jù)模擬生產(chǎn)狀態(tài)下取得的試驗研究數(shù)據(jù)制定廢棄收獲液的標準；生產(chǎn)工藝須包括有效的病毒和 /或致瘤性成分的滅活 /去除方法并經(jīng)過充分驗證。如果整個培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和 /或限制代次、培養(yǎng)方式等發(fā)生重大改進，細胞培養(yǎng)工藝進行了放大，影響了原已確定的監(jiān)控標準，應(yīng)重復(fù)進行一次全面的檢測驗證。常規(guī)生產(chǎn)過程監(jiān)控經(jīng)研究確定了生產(chǎn)工藝條件之后，常規(guī)生產(chǎn)過程中可重點監(jiān)測微生物污染和細胞生長狀況，例如活細胞數(shù)目和形態(tài)、代謝和功能狀態(tài)、目的蛋白表達狀況、潛伏性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組激活狀況、細菌和支原體污染以及其它要求 [1]等，在比較分析的基礎(chǔ)上確定批次或者連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)的終末細胞的檢測項目及可接受標準。細胞增殖限度在細胞穩(wěn)定性試驗研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)結(jié)合細胞培養(yǎng)、維持等工藝過程中實際采用的生產(chǎn)方式如批式培養(yǎng)( batchculture)、流加培養(yǎng)(fed-batchculture)、灌注培養(yǎng) (perfusionculture)等各自特點，考察細胞體外連續(xù)擴增、培養(yǎng)過程中發(fā)生的變化，例如細胞的生長狀態(tài)、內(nèi)源性病毒抑制狀態(tài)、目的蛋白表達的下降程度以及致瘤性改變等確定適宜的收獲方式、收獲時間、細胞終止培養(yǎng)時間和 /或增殖代次，并預(yù)留充分的安全儲備。實際生產(chǎn)過程中細胞不得超過預(yù)先設(shè)定的培養(yǎng)時間和 /或增殖限度。其它風(fēng)險性因素控制培養(yǎng)基對細胞的質(zhì)量有直接的影響，也是細胞污染的可能來源之一。應(yīng)明確培養(yǎng)基的組成、來源及質(zhì)量標準。對于動物源性添加成分，應(yīng)盡可能控制并減少其使用；如確需使用，應(yīng)闡明選擇的理由，并說明該成分的來源和病毒安全性控制方法 。目前提倡采用無血清培養(yǎng)基，并盡可能減少用于處理細胞(例如從貼壁狀態(tài)中游離或者分散)的動物來源的蛋白酶。各種培養(yǎng)基的來源和質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)均應(yīng)有可追溯的文件記錄。如培養(yǎng)中使用了牛源性物質(zhì)，應(yīng)明確其來自非 BSE疫區(qū)，并應(yīng)按照國家食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定提供必要的證明性文件。細胞培養(yǎng)條件的研究中， 應(yīng)考察使內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制和癌基因相關(guān)序列激活或者復(fù)制受抑制的控制條件， 對模擬生產(chǎn)條件下的狀況進行分析，確定可實際控制的程度。生產(chǎn)中應(yīng)嚴格執(zhí)行研究確定的控制條件。小結(jié)宿主細胞來源應(yīng)明確，其建立、傳代和培養(yǎng)歷史清楚，鑒定結(jié)果可靠，遺傳、生物學(xué)背景可追溯；工程細胞的克隆構(gòu)建、篩選過程應(yīng)規(guī)范，克隆原始細胞在比較優(yōu)化的基礎(chǔ)上經(jīng)過確認檢測；起始細胞穩(wěn)定、均一和同質(zhì)，建立了規(guī)范的細胞庫(以下簡稱庫細胞)并經(jīng)過充分檢定，保存的數(shù)目和傳代水平應(yīng)保證生產(chǎn)用細胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)；對于原始庫和 /或主庫細胞，應(yīng)進行過至少一次全面系統(tǒng)的研究檢定；工作庫細胞經(jīng)過簡化項目的檢定和外源因子污染檢測，沒有混入其它細胞；生產(chǎn)用 WCB細胞每次復(fù)蘇后應(yīng)經(jīng)過有代表性意義的常規(guī)質(zhì)控項目的檢測分析，以證實庫細胞在復(fù)蘇時仍保持原凍存時預(yù)期的細胞特征。在細胞培養(yǎng)工藝研究階段，對生產(chǎn)終末細胞和 /或超過培養(yǎng)限定代次的細胞應(yīng)進行過一次全面系統(tǒng)的檢測分析研究，包括一般檢定、遺傳和生物學(xué)特征檢測分析、目的基因和表達框架的穩(wěn)定性分析、外源因子污染狀況分析、內(nèi)源性病毒激活或復(fù)制抑制狀態(tài)檢測、致瘤性改變以及其它需要嚴格限制的因素等； 細胞應(yīng)經(jīng)過全面的穩(wěn)定性研究考察， 以確定庫細胞的限傳代次和生產(chǎn)細胞適宜的擴增控制水平，并在生產(chǎn)過程中嚴格執(zhí)行限定的要求。重組工程細胞在整個培養(yǎng)生產(chǎn)過程中其遺傳學(xué)和生物學(xué)特征應(yīng)保持穩(wěn)定； 生產(chǎn)中設(shè)立了適宜的監(jiān)控指標， 動態(tài)跟蹤監(jiān)測細胞的增殖、生長、污染等狀況，并控制在警戒范圍內(nèi)。對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和 /或致瘤性試驗陽性的細胞，病毒和 /或癌基因相關(guān)序列的激活或者復(fù)制應(yīng)受到嚴格控制， 制定廢棄收獲液的標準， 生產(chǎn)工藝包含有效的病毒和 /或致瘤性成分的滅活 /去除方法并經(jīng)過充分驗證， 純化步驟能夠使病毒和 /或致瘤性成分得到有效去除，并嚴格執(zhí)行研究確定的控制條件；細胞培養(yǎng)基的來源和質(zhì)量標準應(yīng)明確，動物源性添加成分須符合國家有關(guān)規(guī)定；總之，細胞質(zhì)量研究、檢測和監(jiān)控應(yīng)包括從起始的庫細胞至生產(chǎn)終末的整個擴增培養(yǎng)全過程，使細胞始終能夠正常表達、分泌具有生物活性的目的產(chǎn)物，微生物污染、致瘤性等風(fēng)險性因素得到有效控制。9、名詞解釋宿主細胞：系指用以載納和表達外源目的基因的細胞系或者細胞株。重組工程細胞：系指攜帶有外源目的基因并能夠持續(xù)穩(wěn)定表達重組目的產(chǎn)物的工程化細胞。細胞增殖限度：在既定培養(yǎng)條件下，庫細胞從復(fù)蘇開始至生產(chǎn)終末期為止的整個培養(yǎng)過程中，為有效控制細胞生長狀態(tài)或者變異的程度，使其始終處于持續(xù)、穩(wěn)定的表達狀態(tài)所界定的相關(guān)要求，包括庫細胞限傳代次和生產(chǎn)細胞培養(yǎng)限度。通常采用固定條件下細胞培養(yǎng)和維持時間、細胞群體倍增水平或者限傳代次等指標加以限制。細胞庫、原始細胞庫、主細胞庫、工作細胞庫的概念和定義見參考文獻 [1]。10、參考文獻1、中華人民共和國藥典 2005年版三部 .生物制品生產(chǎn)用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程， 2005FDA.Pointstoconsiderincharacterizationofcelllinesusedtoproducebiologicalproducts,1989FDA.Pointstoconsiderforthecharacterizationofcelllinesusedtoproducebiologicalsandforthemanufacturingandtestingofmonoclonalantibodyforhumanuse，1997ICH.Guidelineforviralsafetyevaluationofbiotechnologyproductsderivedfromcelllinesofhumanandanimalorigin,1996EMEA.Positionstatementontheuseoftumourigeniccellsofhumanoriginfortheproductionofbiologicalandbiotechnologicalmedicinalproducts,20014.64.6關(guān)于病毒顆粒的電鏡檢查重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則起草說明哺乳動物細胞用于生產(chǎn)治療性重組制品，特別是單克隆抗體藥物的臨床應(yīng)用 近年來呈現(xiàn)上升的趨勢，國內(nèi)相應(yīng)的研究、開發(fā)和進入臨床試驗的項目也逐漸增多。 但目前僅根據(jù)文獻報道和可獲得的有限背景資料， 未經(jīng)全面系統(tǒng)的試驗研究和檢測分析就直接引進和使用能夠獲取的宿主細胞現(xiàn)象比較普遍。 對于重組工程細胞的質(zhì)量分析只有零碎、 不完整的試驗研究。 而關(guān)于細胞質(zhì)量控制已有的指導(dǎo)原則和技術(shù)評價一般原則，主要針對生產(chǎn)疫苗的細胞基質(zhì)、 腹水法生產(chǎn)抗體的雜交瘤細胞以及體細胞治療等， 其中相關(guān)的內(nèi)容雖具有普遍的指導(dǎo)意義， 但對于重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制特殊問題的考慮尚不夠充分和具體，亟需單獨起草具有實際針對性的技術(shù)評價一般原則， 以完整、全面闡述技術(shù)評價的基本內(nèi)容和相關(guān)要求，引導(dǎo)用于重組產(chǎn)品的哺乳動物細胞質(zhì)量控制的相關(guān)研究工作。1、起草指導(dǎo)思想細胞質(zhì)量的研究和控制是生產(chǎn)重組制品的核心組成部分， 維持良好的培養(yǎng)細胞和表達狀態(tài)需要從庫細胞到生產(chǎn)過程的全面質(zhì)量研究。 基于國內(nèi)外該領(lǐng)域目前存在的實際差距， 并考慮國內(nèi)今后發(fā)展的趨勢和要求， 為從研發(fā)的起始階段對于細胞質(zhì)量控制研究方案提供參考依據(jù)， 設(shè)計和規(guī)劃科學(xué)的研究項目，規(guī)范技術(shù)審評和研究開發(fā)所面臨的共同問題， 中心成立了本課題研究小組。根據(jù)目前在技術(shù)審評中發(fā)現(xiàn)的細胞質(zhì)量控制方面的共性突出問題，結(jié)合現(xiàn)有指導(dǎo)原則和技術(shù)評價一般原則適用的部分，國外指導(dǎo)原則的一般考慮，起草了本技術(shù)評價一般原則。期望能夠引導(dǎo)和促進細胞質(zhì)量控制工作的全面性、系統(tǒng)性和完整性，加強重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制的研究工作。2、與其它指導(dǎo)原則的關(guān)系關(guān)于細胞質(zhì)量研究、控制及重組制品的技術(shù)要求，國家局已頒布《人體細胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》、《人用重組 DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》 、《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》 ；藥品審評中心已公布 《疫苗生產(chǎn)用細胞基質(zhì)技術(shù)審評一般原則》 、《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術(shù)審評一般原則》 ；特別是《中華人民共和國藥典》 （2005年版）三部通則， 對于“生物制品生產(chǎn)用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程 ”已有明確要求。本文的起草中參考了相關(guān)的內(nèi)容，在與上述文件的相關(guān)要求保持一致的基礎(chǔ)上，針對重組哺乳動物細胞的質(zhì)量控制特點，補充提出更加具體化的技術(shù)評價基本原則，相同的部分以參見的方式直接引用，不再重復(fù)有關(guān)內(nèi)容。3、重點內(nèi)容和基本原則在明確篩選宿主細胞的一般原則基礎(chǔ)上， 嚴格控制致瘤性、 內(nèi)源性病毒等風(fēng)險性因素； 對于建庫后的重組工程細胞強調(diào)必須經(jīng)過全面的檢定，增加了針對目的基因和表達框架的具體要求； 庫細胞的傳代和生產(chǎn)細胞的擴增培養(yǎng)須建立限定要求， 穩(wěn)定性研究應(yīng)包括庫細胞、 生產(chǎn)過程中細胞、培養(yǎng)終末期和 /或超過終末期等不同培養(yǎng)時期的細胞，闡述了需要重點考察的主要內(nèi)容和檢測項目，并嚴格要求生產(chǎn)中不得超出研究確定的許可代次；對于致瘤性陽性細胞系風(fēng)險性因素的控制必須在早期階段同步重視，研究確定內(nèi)源性病毒 /癌基因抑制的條件并應(yīng)用于實際生產(chǎn)過程中；生產(chǎn)工藝中采用的病毒滅活 /去除方法和純化工藝中去除宿主細胞的 DNA及其它致腫瘤成分的效果須經(jīng)充分驗證， 嚴格控制風(fēng)險性成分的殘留量；細胞培養(yǎng)相關(guān)的技術(shù)條件和工藝參數(shù)變更或者培養(yǎng)工藝放大后等，需要重新對細胞質(zhì)量進行全面檢測分析等。通過上述技術(shù)評價內(nèi)容的闡釋， 提出本技術(shù)審評的一般原則， 以引導(dǎo)細胞質(zhì)量控制研究工作包括從庫細胞、生產(chǎn)過程細胞至培養(yǎng)終末細胞的全過程，在各個階段進行完整系統(tǒng)的檢測分析。4、細節(jié)性技術(shù)問題說明關(guān)于名稱含義哺乳動物細胞可以泛指各種哺乳動物來源的真核細胞，包括原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞及腫瘤細胞。目前已成功用于生產(chǎn)重組制品的細胞主要有嚙齒類傳代細胞系如 CHO、BHK、C127等。具有體外長期傳代和生存能力的宿主細胞是滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)實際需要的基本前提。因此，本文中闡述的內(nèi)容主要與傳代細胞有關(guān)。 鑒于國內(nèi)外有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則已將 “生產(chǎn)重組制品用哺乳動物細胞 ”賦予了特定的含義， 為便于理解和保持既有的概念，本文仍沿用業(yè)界已慣用的習(xí)語，暫擬訂 “生產(chǎn)重組制品用哺乳動物細胞 ”名稱。關(guān)于細胞的來源由于該方面的資料僅與溯源性有關(guān)，主要用于佐證細胞的構(gòu)建歷史過程。因此，在正文中對于建株 /系細胞來源動物的種屬、年齡、性別和健康檢疫狀態(tài)，最初來源實驗室的研究資料或者引用正式發(fā)表的文獻資料， 引進細胞的制備和分發(fā)機構(gòu)等未提出強制性要求，建議盡可能提供宿主細胞的特征如鑒別標志，種屬鑒定如鼠源、人源和其它動物來源的確證資料；關(guān)于傳代歷史，研究機構(gòu)應(yīng)對于細胞在不同試驗室或者研究機構(gòu)引進、保存、傳代培養(yǎng)等周轉(zhuǎn)過程中所經(jīng)歷事件有詳細記錄和說明，用于建檔和備查，不須在申報資料中提供。但應(yīng)有說明性材料，包括傳代過程所用的人源或動物源性材料。表達載體構(gòu)建過程和重組工程細胞的篩選此部分研究工作系指將含有重組產(chǎn)物基因編碼序列的表達載體導(dǎo)入宿主細胞， 從而構(gòu)建成可表達目的產(chǎn)物的工程細胞。 正文未對此過程詳細解釋和說明，沒有要求提供具體資料，而是直接闡述需要關(guān)注的重點內(nèi)容。但研究機構(gòu)應(yīng)有對應(yīng)建檔資料備查，如質(zhì)粒載體系外購，應(yīng)明確其來源并備有相關(guān)證明；如系研制單位自己構(gòu)建或在商品化質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上進行了改造，則應(yīng)詳述構(gòu)建或改建的過程，并附圖示說明。篩選方案中應(yīng)有采用了何種篩選標記（ 如抗性及其它營養(yǎng)缺陷選擇性等）、何種特定的培養(yǎng)條件的詳細資料。上述關(guān)于重組工程細胞的構(gòu)建、 篩選和鑒定的資料， 從評價的角度主要關(guān)注其資料的完整性和翔實性。 此部分資料作為工程細胞的背景資料不但反映了生產(chǎn)用細胞的可溯源性， 也可為后續(xù)細胞庫的管理和質(zhì)量評估以及細胞培養(yǎng)條件控制等提供必要的基礎(chǔ)信息。 但屬于研究單位自身應(yīng)重視的基本問題，是獲取正確重組工程細胞的基礎(chǔ)，由于后續(xù)種子庫細胞的具體檢定將提供直接的證據(jù)，因此未在正文中提出具體要求。目的基因和表達框架的檢測分析正文沒有解釋和強調(diào)測序工作的重要性和實際意見， 僅提出測序確證應(yīng)貫穿于重組工程細胞的研究建立和生產(chǎn)應(yīng)用整個過程。 對于選定的工程細胞株應(yīng)進行充分的目的基因序列確認， 以保證用于編碼和表達目的產(chǎn)物的基因在初始核酸序列上的正確性。 鑒于目前對于大分子蛋白質(zhì)進行全序列分析尚有相當大的難度， 即使嘗試進行全序列分析也難以檢測到所有基因編碼序列突變造成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化， 所以進行核酸水平的序列確認是非常必要的。核酸分析的目的不是為了檢測少量的變異序列， 而是為了保證所表達的蛋白有正確的氨基酸順序。當工程細胞包含有多個整合拷貝時，并非所有的拷貝均有轉(zhuǎn)錄活性，因此對 mRNA或cDNA進行序列分析，即測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物本身，也許比對基因組 DNA的分析更合適。對混合克隆細胞或聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進行測定，也許可替代依靠選擇單一 DNA克隆的方法（適宜對細胞庫和培養(yǎng)過程中的細胞進行序列分析）。也可考慮采用其他快速、靈敏和準確的核酸序列分析方法。關(guān)于目的基因存在形式和功能狀態(tài)的分析研究， 由于目前國內(nèi)外檢測的技術(shù)手段和具體方法有所不同， 考慮到應(yīng)用的普遍性和分析難度， 如提出統(tǒng)一具體的強制性要求，則缺乏支持的基礎(chǔ)。因此，正文中未對整合位點檢測（ SouthBlot）， mRNA大小分析（ NorthernBlot），編碼序列的完整性（ cDNA測序）檢測等提出具體要求，有條件的情況下建議在 MCB細胞和生產(chǎn)終末期細胞進行這些試驗， WCB可以進行 mRNA分析及拷貝數(shù)檢測。關(guān)于外源因子檢查中國藥典三部有具體的要求，可使用人二倍體細胞系 （MRC-5）、猴腎細胞系 （Vero）以及在種屬和組織類型上與用于生產(chǎn)完全相同的細胞，并選擇合適的陽性對照。一般培養(yǎng) 14天，觀察有無細胞病變，檢測紅細胞吸附和血細胞凝集（這些現(xiàn)象提示有病毒污染）。在特定條件下，為了鑒別某些病毒，如人巨細胞病毒，可以延長觀察期至 28天。紅細胞吸附和血細胞凝集檢測也是檢定是否有病毒污染的常規(guī)指示試驗。上述內(nèi)容未納入正文，只是提出可以根據(jù)細胞來源，傳代史和細胞培養(yǎng)基的原料使用情況來選擇敏感的多種指示細胞。具體方法參見中國藥典。根據(jù)文獻研究報道，透射電鏡下可觀察細胞基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和病毒樣顆粒 （A,B,C,D和R型）的存在。多數(shù)嚙齒動物細胞（如小鼠雜交瘤、 NS0、Sp2/0和CHO）可以表達由細胞膜芽生或者處于細胞外的 C型顆粒以及囊泡內(nèi) A型顆粒；而 BHK細胞可以表達低水平的囊泡內(nèi) R型顆粒。這些情況我們認為從事細胞質(zhì)量研究和控制的專業(yè)機構(gòu)的分析評價意見將更加深入。因此，未在正文中納入，只是要求在細胞中如果只檢出非感染性的病毒顆粒，須在后期生產(chǎn)中應(yīng)用滅活 /去除工藝并嚴格控制 DNA和宿主蛋白殘留量。4.7關(guān)于無菌試驗和支原體檢查應(yīng)當采取混合細胞培養(yǎng)的上清液樣品，按照現(xiàn)行中國藥典的無菌檢查方法進行檢定，結(jié)果須符合規(guī)定要求。使用的培養(yǎng)基應(yīng)適合需氧菌、厭氧菌和真菌的生長，并且培養(yǎng)基的靈敏度要滿足要求。無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法，如供試品允許，應(yīng)優(yōu)先采用后種方法。對于直接接種法，若制品中含有防腐劑，應(yīng)先行增菌培養(yǎng)。在進行支原體檢查時，應(yīng)注意同時進行培