蛋白質(zhì)的化學(xué)課件

Chapter3

StructureandFunctionofProtein內(nèi)容簡介蛋白質(zhì)的分類及生理學(xué)功能氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)肽的結(jié)構(gòu)和生理功能蛋白質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)和性質(zhì)蛋白質(zhì)的研究技術(shù)第一節(jié)蛋白質(zhì)的分類及生理學(xué)功能蛋白質(zhì)(protein)

是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物三聚氰胺性狀為純白色單斜棱晶體，無味，在水中溶解度隨溫度升高而增大,在20℃時，約為3.3g/L三聚氰胺的含氮量為66％左右。因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量虛高三聚氰胺進(jìn)入人體后，發(fā)生取代反應(yīng)(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成結(jié)石。

1.2蛋白質(zhì)的分類1、根據(jù)分子形狀3、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度：4、根據(jù)蛋白質(zhì)功能活性蛋白質(zhì)（識別）非活性蛋白質(zhì)（保護(hù)）1.3蛋白的生理功能1．酶

2．結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）3．貯藏（卵清蛋白、種子蛋白）4．物質(zhì)運輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）5．細(xì)胞運動（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動蛋白）6．激素功能（胰島素）7．抗體(免疫信號）8．接受、傳遞信息（受體蛋白，味覺蛋白）9．調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）不變部分可變部分手性-碳原子2.1氨基酸的結(jié)構(gòu)-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式COOHCHH2NR氨基酸的立體異構(gòu)體（1）常見的天然氨基酸（2）不常見的稀有氨基酸－－是正常氨基酸的衍生物，在遺傳上沒有直接的三聯(lián)密碼。（3）非蛋白質(zhì)氨基酸－－不在蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的氨基酸。2.2氨基酸的分類苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸

賴氨酸

精氨酸天冬氨酸

谷氨酸天冬酰胺

谷氨酰胺

20種氨基酸的名稱及縮寫代號也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來。(1)4-羥脯氨酸(2)5-羥賴氨酸

這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。(3)6-N-甲基賴氨酸（存在于肌球蛋白中）

(4)г-羧基谷氨酸：存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。

(5)Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲狀腺素（甲狀腺蛋白中）(6)鎖鏈素由4個Lys組成（彈性蛋白中）。

(2)非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能（1）L-型α–氨基酸的衍生物L(fēng)-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。

(3)非蛋白質(zhì)氨基酸2.3氨基酸的一般物理性質(zhì)（1）無色晶體，熔點極高，一般在200℃以上（2）不同氨基酸有不同的味感（3）能溶于稀酸或稀堿，不溶于有機(jī)溶劑(酸性的－COOH基和堿性的－NH2基，為兩性電解質(zhì))（4）極性色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最強(qiáng)。氨基酸的紫外吸收光譜（6）紫外吸收性質(zhì)可用于蛋白定量檢測（1）與亞硝酸的反應(yīng)(氧化還原性）（2）成鹽作用（HCl，堿性）（3）與甲醛的反應(yīng)（親核性）（4）?；c烴基化反應(yīng)（親核性）（5）脫氨反應(yīng)（氨基酸的代謝,酶催化）2.4氨基酸的化學(xué)通性（一）由氨基參加的反應(yīng)用途：N末端氨基酸測定AA與丹磺酰氯的反應(yīng)（3）酰基化與烴基化反應(yīng)（熒光）熒光性質(zhì)，使檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。用途：Sanger反應(yīng)，N末端氨基酸測定AA與二硝基氟苯（DNFB）的反應(yīng)（黃色）實際上也是一種N-端分析法。此法能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。PTH-AAEdman（苯異硫氰酸酯法）-氨基酸順序分析法（1）成酯和成鹽反應(yīng)（+醇）（2）成酰胺反應(yīng)（Asn，Gln）（3）酰氯化反應(yīng)（酰化氨基酸）（4）疊氮反應(yīng)（5）脫羧反應(yīng)（+酶)（二）由羧基參加的反應(yīng)a.AA+NaOH－→氨基酸鈉鹽(氨基酸的堿金屬鹽能溶于水,重金屬鹽不溶于水)b.HCl

AA+EtOH－→氨基酸乙酯的鹽酸鹽

成鹽成酯反應(yīng)形成酰鹵的反應(yīng)用途：這是使氨基酸羧基活化的一個重要反應(yīng)。保護(hù)基簡寫（胺基?；；坊B氮化反應(yīng)用途：常作為多肽合成活性中間體，活化羧基。經(jīng)過?；?、酯化變成酰化氨基酸甲酯，再與聯(lián)氨和亞硝酸作用，生成疊氮化合物。脫羧反應(yīng)用途：酶催化的反應(yīng)。(三)由氨基和羧基共同參加的反應(yīng)（1）與茚三酮的反應(yīng)（2）氨基酸的兩性解離（3）形成肽鍵（1）AA與茚三酮反應(yīng)用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。(pro黃色）水合茚三酮茚三酮藍(lán)紫色（2）兩性解離及等電點甘氨酸的解離曲線起點：100%Gly+凈電荷：+1第一拐點：50%Gly+，50%Gly±平均凈電荷：+0.5pH=pK1+lg[Gly±]/[Gly+](羧基解離)(pK1=2.34)第二拐點：100%Gly±凈電荷：0等電點pI第三拐點：50%Gly±，50%Gly-平均凈電荷：-0.5pH=pK2+lg[Gly]/[Gly±](氨基解離)(pK2=9.6)終點：100%Gly-凈電荷：-1等電點偏酸在于羧基解離度大于氨基解離度pH=pK+lg([質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體])在適當(dāng)?shù)乃釅A度時，氨基酸溶液中-NH3+和COO-解離度完全相同，此時正離子和負(fù)離子濃度相同，凈電荷為零；在電場中既不向陽極移動也不向陰極移動，成為兩性離子（或兼性離子），這時氨基酸所處溶液中的pH值就是該氨基酸的等電點（pI）。等電點（pI）時溶解度最小。等離子點VS等電點（等電點受離子濃度干擾）等電點的概念等電點的推導(dǎo)[Ala+]=[Ala±][H+]K1移項：[Ala-]=[Ala±]K2[H+]根據(jù)等電點的定義:[Ala+]=[Ala-][Ala±][H+]K1[Ala±]K2[H+]=整理：K1K2

[Ala±]=[Ala±][H+][H+]K1K2=[H+]2兩端取對數(shù)：-lg[H+]2

=-lgK1-lgK2∵-lgK1=

pk1-lgK2=

pk2

∴2（-lg[H+]）=pk1+pk2根據(jù)pH的定義得：pH=lg1/[H+]=-lg[H+]∴2pH=pk1+pk2pI=1/2(pk1+pk2

)中性氨基酸：pI=(pK1+pK2)/2酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2堿性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2pK1指α-羧基解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)值；

pK2指α-氨基解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)值；

pKR指側(cè)鏈R基解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)值。氨基酸等電點計算對谷氨酸：A+AoA-A2-2.194.259.67pI＝（2.19+4.25）/2＝3.22對賴氨酸：A2+A+AoA-2.188.9510.53pI＝（8.95+10.53）/2＝9.74（3）形成肽鍵（peptidebond）氨基酸殘基與肽單位(四)由支鏈R基產(chǎn)生的反應(yīng)第三節(jié)肽的結(jié)構(gòu)和生理功能谷胱甘肽（GSH）的一級結(jié)構(gòu)谷胱甘肽的生理功用解毒作用：與毒物或藥物結(jié)合，消除其毒性作用；參與氧化還原反應(yīng)：作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)；保護(hù)巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團(tuán)-SH維持還原狀態(tài)；維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：消除氧化劑對紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。肽概述(1)形成：脫水縮合(2)命名：NCA肽也是以兩性離子形式存在，一般為鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)。羧基端為C-端，氨基端為N-端。書寫時，N-端在左，C-端在右。N-端C-端肽鍵B肽的結(jié)構(gòu)不僅取決于氨基酸的種類和數(shù)目，而且還取決于它們之間的連接次序。如甘氨酰丙氨酸丙氨酰甘氨酸這是少數(shù)幾種氨基酸可以形成各式豐富多彩的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。

C肽的命名以C-端的氨基酸為母體，稱為某氨酸。其它氨基酸殘基則從N-端開始，依次用某氨酰表示，放在母體前。如谷氨酸殘基半胱氨酸殘基甘氨酸殘基g-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷胱甘肽簡稱：g-Glu-Cys-Gly；g-谷-胱-甘(3)分類：寡肽VS多肽（構(gòu)成單元大于10稱為多肽）(4)酸堿性：兩端氨基酸殘基的酸堿性,酸的偏向不酸；堿的偏向不堿（兩端氨基酸殘基官能團(tuán)為正負(fù)離子，有吸引力作用，導(dǎo)致酸堿性增加，而肽鏈變長后這種引力降低）谷胱甘肽（GSH）的一級結(jié)構(gòu)生物活性肽活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽肽的生理功能-活性肽與氨基酸生理差別肽以完整的形式被機(jī)體吸收(肽通過十二指腸吸收后，直接進(jìn)入血液循環(huán)，將自身能量營養(yǎng)輸送到人體各個部位)，小肽也是逆濃度梯度轉(zhuǎn)運，主要依賴H+濃度或Ca2+離子濃度轉(zhuǎn)運。小肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運速度快、耗能低、不易飽和等特點。（氨基酸屬主動轉(zhuǎn)運，要氨基酸載體）,較氨基酸吸收快速,同時吸收過程低耗或不需消耗能量,吸收具有不飽和的特點氨基酸只有20種，功能可數(shù)，而肽以氨基酸為底物，可合成上百上千種,可執(zhí)行復(fù)雜生理功能.

肽是信息的信使，以引起各種各樣不同的實效的正性或異性生理活動和生化反應(yīng)調(diào)節(jié)（蛋白相比執(zhí)行其它功能更多,但很多情況下活性肽活性較高）分子量小，易于改造，易于化學(xué)合成，而高蛋白（大分子蛋白質(zhì)）不具備這一特點肽的生理功能-活性肽與蛋白質(zhì)生理差別若氨基酸為二度深度開發(fā)，肽就是高蛋白的三度深度開發(fā)產(chǎn)品第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)蛋白質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系蛋白質(zhì)的一些性質(zhì)4.1蛋白質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)----基本結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)

★其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。胰島素（Insulin）的一級結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)：指一級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤繞折疊，其主鏈形成的局部構(gòu)象。二級結(jié)構(gòu)的類型：主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。維持二級結(jié)構(gòu)的力：主要是氫鍵。二級結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)-肽平面肽平面形成是由于N元素以sp2雜化方式,使其結(jié)構(gòu)中的孤對電子和氧共軛的結(jié)果C元素電子云也以sp2方式雜化導(dǎo)致六個原子在同一平面上肽平面內(nèi)各個鍵的鍵長和鍵角肽鍵

肽鍵（酰胺鍵）C－N長度為0.133nm比C＝N（0.125nm）長，但比一般的C－N單鍵（0.145nm）短，所以肽鍵具有部分雙鍵特性（約具有40％雙鍵特性）。肽平面繞N-C鍵旋轉(zhuǎn)角度用表示繞C-C鍵旋轉(zhuǎn)的角度用表示從C沿健軸方向觀察，順時針方向為正，反時針為負(fù)。NC羧基碳Aa基本結(jié)構(gòu)理論上和可以?。?80°至＋180°之間的任一個角度。但由于旋轉(zhuǎn)時酰胺氫和羰基氧之間的位阻，所以并不是任意二面角（，）都是立體化學(xué)所允許的。上圖表示肽鏈中的肽單位處于一種伸展?fàn)顟B(tài)；下圖表示的是肽單位處于一種不穩(wěn)定構(gòu)象，這是由于相鄰氨基酸殘基的羰基氧之間的立體干擾引起的，虛線表示的是羰基氧原子的vanderWaals半徑。旋轉(zhuǎn)本身受到肽鏈的主鏈和相鄰殘基的側(cè)鏈原子之間的立體干擾的限制。原子間作用是限制并形成高級構(gòu)象的動力肽平面和二面角示意圖R基分布在螺旋的外側(cè)，并且影響著螺旋的形成。主鏈圍繞中心軸呈有規(guī)律螺旋式上升，形成右手螺旋；旋轉(zhuǎn)一周為3.6個氨基酸殘基；螺距為0.54nm；其結(jié)構(gòu)靠第一個肽平面上的-NH基與第四個肽平面上的-CO基形成的氫鍵維持，氫鍵的取向幾乎與軸平行；（1）α-螺旋的特征二級結(jié)構(gòu)的類型（4條α-螺旋）原纖維微原纖維（11條α-螺旋）巨原纖維紡錘體型皮質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)膜皮質(zhì)髓質(zhì)頭發(fā)頭發(fā)結(jié)構(gòu)燙發(fā)實際上是一個生物化學(xué)過程還原做卷氧化紡錘體型皮質(zhì)細(xì)胞含有眾多的二硫鍵左手/右手α-螺旋影響α-螺旋穩(wěn)定的因素極大的側(cè)鏈基團(tuán)（存在空間位阻）；連續(xù)存在的側(cè)鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基（同種電荷的互斥效應(yīng))；有脯氨酸、羥脯氨酸的存在（不能形成氫鍵）。（各種聚合氨基酸成螺旋小結(jié)）Gly能形成（無R基團(tuán)妨礙氫鍵形成）Asp、Lys不能形成（側(cè)鏈帶電荷排斥）＊在一定pH范圍內(nèi)Pro不能形成（不能形成氫鍵）Leu不容易形成(R基團(tuán)較大，妨礙氫鍵形成）（2）β-折迭的特征由若干條肽段或肽鏈平行或反平行排列組成片狀結(jié)構(gòu)；主鏈骨架上下折疊呈鋸齒狀（AA長0.36nm)；借相鄰主鏈之間的氫鍵維系。R基交替分布在片層的上下方。二級結(jié)構(gòu)的類型β-折迭包括平行式和反平行式兩種類型（3）β-轉(zhuǎn)角的特征主鏈骨架本身以大約180°回折;

回折部分通常由四個氨基酸殘基構(gòu)成;

構(gòu)象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來維系。二級結(jié)構(gòu)的類型（4）無規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無規(guī)律的卷曲構(gòu)象對于構(gòu)造蛋白執(zhí)行功能的所需的柔性結(jié)構(gòu)來說具有重要意義二級結(jié)構(gòu)的類型

Viewofconformationalchange:RNase的分子結(jié)構(gòu)α-螺旋β-折迭β-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)溶菌酶分子的三級結(jié)構(gòu)(1)主要是非共價鍵（次級鍵），如疏水鍵、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等；(2)但也有共價鍵，如二硫鍵等。疏水作用是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最主要的穩(wěn)定力。疏水基團(tuán)因疏水作用而聚向分子內(nèi)部，親水基團(tuán)多分布在分子表面。因此，具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)都是親水的。維系三級結(jié)構(gòu)的力

鍵能肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價鍵，稱次級鍵提問：次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大（四）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)由兩條或兩條以上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈相互締結(jié)在一起的聚合體。其中每條具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈為一個亞基。維系蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的力是次級鍵。偶數(shù)亞基，排列對稱。血紅蛋白(hemoglobin)的四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)優(yōu)越性1、共價鍵：二硫鍵、肽鍵、酯鍵；2、非共價鍵：氫鍵、離子鍵、疏水鍵和范德華力一級結(jié)構(gòu)：共價鍵二級結(jié)構(gòu)：氫鍵三、四級結(jié)構(gòu)：次級鍵（五）維系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的鍵及作用力隨著結(jié)構(gòu)層次上升,鍵的作用能力越弱,符合物質(zhì)構(gòu)成一般規(guī)律穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的力鹽鍵氫鍵疏水鍵范德華力二硫鍵酯鍵4.2蛋白結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)而影響功能蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)決定了其功能(1)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)而影響功能

(1)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)而影響功能

鐮狀細(xì)胞貧血（sick-cellanemia）從患者紅細(xì)胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細(xì)胞。β-鏈1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…

Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑點含氧HbS脫氧HbS疏水位點血紅蛋白分子凝集(2)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)直接決定其功能高級結(jié)構(gòu)變化，其許多結(jié)構(gòu)性質(zhì)就會改變（如變性失活）高級結(jié)構(gòu)及構(gòu)象微調(diào)，其活性也會發(fā)生很大變化．血紅蛋白血紅蛋白構(gòu)象的微調(diào)-構(gòu)象改變-生理功能改變血紅素在蛋白中的位置血紅素氧結(jié)合引起蛋白局部構(gòu)象變化局部構(gòu)象變化引發(fā)關(guān)聯(lián)蛋白構(gòu)象變化

氧氣結(jié)合最終引起整體構(gòu)象變化氧結(jié)合形成的構(gòu)象改變，改變了四級結(jié)構(gòu)相成的鹽鍵，使其它亞基構(gòu)象變化，使其它亞基轉(zhuǎn)變?yōu)楦H氧構(gòu)象，形成協(xié)同作用．方便了氧的運輸．可以通過其它分子限制蛋白構(gòu)象的微調(diào)變化4.3蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(一)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量很大，但它在水中能夠形成膠體溶液(蛋白表面有帶電基團(tuán),但不同于化學(xué)溶膠吸附金屬離子而帶電)。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運動等水膜和同種電荷排斥作用是膠體穩(wěn)定的原因

利用膠體性質(zhì)可用于蛋白的分離：蛋白沉淀

由前述可知,維持蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的主要因素是蛋白質(zhì)分子表面的水化膜和雙電層。若用化學(xué)或物理的方法破壞蛋白質(zhì)的這兩種因素，則蛋白質(zhì)分子將凝聚而沉淀。方法有：等電點沉淀法：蛋白顆粒間無電荷的排斥作用，易于形成聚集成大顆粒，不穩(wěn)定，易于沉淀析出。鹽析：中性鹽（硫酸銨）既中和蛋白所帶電荷又破壞水化膜。分段鹽析有機(jī)溶劑沉淀以及重金屬鹽或者生物堿或酸試劑沉淀蛋白質(zhì)：其作用，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象也可產(chǎn)生沉淀。變性的蛋白質(zhì)不一定沉淀，沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性。其它沉淀方式因酸、重金屬鹽類或者生物堿試劑的作用，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象也可產(chǎn)生沉淀。

變性的蛋白質(zhì)不一定沉淀，沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性。蛋白質(zhì)在等電點偏酸溶液中帶正電荷，在等電點偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點時為兼性離子。蛋白質(zhì)是人體重要的緩沖劑。（二）兩性解離性質(zhì)(電性)

蛋白質(zhì)不管肽鏈有多長仍有自由的-NH2或-CO2H存在，在肽鏈的側(cè)鏈也有尚未結(jié)合的極性基團(tuán)，如賴氨酸的氨基、谷氨酸的羧基、半胱氨酸的巰基等。這些堿性、酸性基團(tuán)在溶液中會解離（兩性離子），解離的程度與離子的性質(zhì)、溶液的pH值、蛋白質(zhì)中游離基團(tuán)的性質(zhì)合數(shù)目等有關(guān)。其兩性解離可表示為兩性pH=pI負(fù)離子pH>pI正離子pH<pI

可見，在酸性溶液中蛋白質(zhì)解離成陽離子，在堿性溶液中解離成陰離子.在某個pH值時蛋白質(zhì)成兩性離子，所帶正負(fù)電荷相等,此pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(pI),不同的蛋白質(zhì)有不同的pI值。１)測定蛋白質(zhì)等電點必須在有一定離子濃度的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行(離子強(qiáng)度影響H+解離)２)在水溶液中，蛋白質(zhì)的等電點一般偏酸，因為羧基的解離度比氨基的大。３)等電點時蛋白質(zhì)的導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓等都是最小蛋白質(zhì)的等電點電泳現(xiàn)象在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。當(dāng)溶液pH=等電點時，蛋白質(zhì)粒子凈電荷為零，在電場中不移動；當(dāng)溶液pH＞等電點時，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；當(dāng)溶液pH＜等電點時，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。不同電荷量的蛋白,在紙電泳時,遷移距離不同（三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)的變性（denaturation）在某些物理或化學(xué)因素的作用下，天然蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性。（主要是次級鍵變化）肽鍵不變、次級鍵變化，一級結(jié)構(gòu)不變，分為可逆變性（3級以上結(jié)構(gòu)被破壞）與不可逆變性（2級）蛋白質(zhì)的變性

(thedenaturationofproteins)天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其共價鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失。引起蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：高溫－－破壞次級鍵、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等.

化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿－－破壞鹽鍵有機(jī)溶劑（二甲基甲酰胺）－－破壞氫鍵去污劑、尿素－－破壞疏水作用和氫鍵物理性質(zhì)：旋光性改變?nèi)芙舛认陆党两德噬吖馕斩仍黾踊瘜W(xué)性質(zhì)：官能團(tuán)反應(yīng)性增加易被蛋白酶水解生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失抗原性改變都與蛋白構(gòu)象改變\基團(tuán)外露有關(guān)變性蛋白質(zhì)的特征蛋白質(zhì)的變性如不超過一定的限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。與導(dǎo)致變性的因素、蛋白質(zhì)種類、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變程度相關(guān)。蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）核糖核酸酶的變性與復(fù)性（四）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲：是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲/兩個以上肽鍵的多肽

+

堿性硫酸銅→

紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物為數(shù)不多的利用蛋白整體性質(zhì)的顯色反應(yīng)反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反應(yīng))乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng))α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反應(yīng))堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基α-氨基酸

蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)—OHN第五節(jié)蛋白質(zhì)研究相關(guān)技術(shù)分離測序鑒定5.1蛋白質(zhì)的分離純化生物組織前處理

粗分級無細(xì)胞提取液

細(xì)分級濃縮的蛋白質(zhì)溶液

精制品(結(jié)晶/凍干粉)鹽析等電點沉淀超濾有機(jī)溶劑分級（一）分離純化的一般程序破碎溶解離心層析電泳（二）分離方法分類介紹(１)分子大?。ǖ鞍踪|(zhì)的透析）利用物質(zhì)分子量、密度、形狀的不同，經(jīng)超速離心后分布于不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比。(１)分子大小（超速離心）(１)分子大小(凝膠過濾分離蛋白質(zhì))概念：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。

(２)溶解度-鹽析鹽析時，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時，通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。分段鹽析：半飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白。(２)溶解度-鹽析

凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。沉淀原理是：A、脫蛋白膠體上水膜作用；B、使水的介電常數(shù)降低，蛋白分子異種電荷相互吸引力增加,蛋白質(zhì)溶解度降低。

(２)溶解度-有機(jī)溶劑沉淀圖

通過DEAE-纖維素將兩種不同帶電性的蛋白質(zhì)分離開。圖中顯示的是帶正電的。離子交換樹脂結(jié)合帶負(fù)電的蛋白(３)電荷差異（離子交換層析）(４)親和特性（親和層析）(1)、末端分析N－末端測定Sanger法Edman法DNS法氨肽酶法C－末端測定肼解法羧肽酶法5.2蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定2、二硫鍵的拆開和肽鏈的分離3、肽鏈的部分水解和肽段的分離（1）溴化氰裂解（2）部分酸水解（3）酶水解（牢記四種酶解方式）?？疾靸?nèi)容酸堿CNBr酶（1）酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時間約20小時。此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；天門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。肽鏈的水解方式（２）堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。（３）部分酸水解稀酸

Asp的羧基端濃酸

羥基氨基酸的氨基端（４）CNbr裂解Met的羧基端專一性好，切點少（５）酶水解目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）