基因敲除與藥學2課件

第八章

基因工程及其在醫(yī)藥工業(yè)中的應用

第四節(jié)目的基因制備和常用分離方法

一、已知基因的獲得：（一）人工合成①根據(jù)已知某種基因的核苷酸序列或某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導出為該多肽編碼的核苷酸序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。②適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)）。

（二）聚合酶鏈反應（PCR）P333圖8-161、定義：又稱基因體外擴增；是在引物的介導下，通過變性、退火、延伸三步循環(huán)反應，體外快速的DNA特異性擴增技術。DNAReplication:

5’

3’dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3’TemplatePrimer5’DNAReplication:3’2、PCR反應原理模擬體內(nèi)DNA復制過程，通過變性、退火、延伸三步反應的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA變性為單鏈，特異的引物在退火過程中與單鏈DNA模板聚合，在靶DNA的指導下引物的3’末端延伸靶DNA的互補鏈，完成一個循環(huán)。理論上，每一循環(huán)使DNA分子擴增一倍，n次循環(huán)后，DNA分子擴增為2n；高溫變性：94℃，目的基因接連為單鏈，以作為擴增的模板；

低溫復性：55～60℃，一對特異性引物分別與模板3’端互補結(jié)合；

適溫延伸：72℃，延伸反應；

5

5Template

DNA5Primer15Primer2

5

555The1stcycleThe2ndcycle

5

5555555平臺期指數(shù)擴增期到達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于模板拷貝數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶的種類及活性.4、PCR反應體系模板：DNA或RNA(逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA)DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶緩沖液系統(tǒng)：Tris-HCl,KCl,Mg2＋底物：相同濃度的dNTP引物5、PCR的主要用途目的基因的克隆基因的體外突變DNA和RNA的微量分析DNA序列測定基因突變分析PCR儀器設備：自動移液器和槍頭微量離心管PCR儀電泳設備SimpleandrapidoperationWideapplicability基因文庫（genelibrary）(G-文庫)：是含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群?；蛭膸旌谢蚪M內(nèi)全部基因片段，包括外顯子和無表達功能的內(nèi)含子序列。每一個克隆只含有一個基因片段，應用時利用探針，從文庫中釣取含有所需目的基因的克隆。

（二）cDNA文庫將不同細胞類型或不同階段細胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將所有cDNA混合體與載體進行連接后，將所有的重組體分子都引入宿主細胞并進行擴增，所得到的分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。cDNA文庫(C-文庫)：是以mRNA合成的互補cDNA的隨機片段的重組DNA克隆群。cDNA文庫不含內(nèi)含子序列，易于表達。具有組織細胞特異性：不同組織細胞、不同發(fā)育階段，基因表達的情況都不相同，應選擇特異表達的細胞及狀態(tài)；C-文庫比G-文庫小得多，更容易篩選。

DNA分子的體外重組過程示意圖一、黏性末端DNA片斷的連接：當在載體和目的基因上有相同的限制酶酶切位點時，用同種限制酶（或同尾酶）使二者產(chǎn)生相同的黏性末端，從而將二者連接。

同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的識別序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G質(zhì)粒載體含目的基因的重組質(zhì)粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA連接酶插入失活示意圖

2、定向克隆法（雙酶切）

為實現(xiàn)定向克隆，可采用兩種不同的限制酶同時酶切，使目的基因兩端具有不同的黏性末端；定向克隆法構(gòu)建重組分子P341

二、平末端DNA片斷的連接：在載體和目的基因上沒有相同的限制酶酶切位點時，采用平末端連接。1、由連接酶進行的連接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸酶S1切去黏性末端的單鏈部分；P310在連接時，所用的ATP及T4DNA連接酶的濃度要比連接粘末端的高些2、同聚物尾連接：P343圖8－23利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和目的基因的3’OH上加上互補的同聚物尾，兩者重組后，空隙由DNA聚合酶Ⅰ填補。

加入同聚體尾（homopolymerictail）連接

TdT：末端轉(zhuǎn)移酶，可將某種單一脫氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端

3、人工接頭法：P343圖8－24

人工接頭（linker）：也稱銜接物，是用化學方法合成的一段由10～20個核苷酸所組成的，具有一個或幾個限制酶識別位點的平頭末端雙鏈寡核苷酸短片段。人工接頭法：用連接酶將人工接頭分子連接在目的基因的末端，再用相關的限制酶切割就可以使目的基因產(chǎn)生黏性末端。雙銜接物法構(gòu)建重組分子P344圖

連接物分子連接平末端的DNA片段示意圖5'3'3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'5'3'BamHⅠ接頭多核苷酸激酶連接酶5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ切割G

C

C

T

A

G5'3'

G

A

T

C

C

G5'3'BamHⅠ切割的質(zhì)粒載體5'3'5'3'G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G重組質(zhì)粒目的基因第六節(jié)重組分子引入受體細胞

一、受體細胞的選擇1、原核/真核表達系統(tǒng)；2、克隆/表達；3、限制和修飾：應為限制酶缺陷型（R-），重組缺陷型（Rec-）；4、互補功能：敏感型，營養(yǎng)缺陷型；5、易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導；6、感染寄生缺陷型。其他：7.遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。8.內(nèi)源蛋白水解酶缺失或蛋白酶含量低細胞，有利于外源蛋白質(zhì)在胞內(nèi)積累。9.具有較好的翻譯后加工機制。二、受體細胞的類型1、原核表達系統(tǒng)：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌；2、真核表達系統(tǒng)：酵母、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（組織培養(yǎng)細胞、胚胎干細胞）；

三、受體細胞的感受態(tài)

重組DNA導入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率的高低與受體的感受態(tài)有關。1、感受態(tài)細胞：細胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加、具有攝取外源DNA的能力的細胞。2、制備感受態(tài)細胞的方法：冰浴中，用一定濃度的CaCl2處理。

四、重組子導入細胞的方法1、轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒導入受體細胞的過程。2、轉(zhuǎn)染：重組DNA包裝成病毒顆粒再來感染受體細胞。3、微注射技術；4、電轉(zhuǎn)化法；5、基因槍技術；6、脂質(zhì)體介導法；

轉(zhuǎn)化（transformation）

定義：

將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。過程：細胞—低溫CaCl2處理—感受態(tài)細胞—加重組DNA—42℃熱休克—重組體吸入細胞—復蘇—涂板（含抗生素）—篩選轉(zhuǎn)化菌落。其它方法：電轉(zhuǎn)化、PEG法等。

重組DNA轉(zhuǎn)化過程示意圖轉(zhuǎn)染（fection）

以噬菌體、粘粒和真核病毒為載體的重組DNA分子，體外經(jīng)包裝成為具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染相應的細胞，并在其中擴增。此過程又叫轉(zhuǎn)導（transduction）。

轉(zhuǎn)染效率》轉(zhuǎn)化效率

顯微注射法

使用機械的方法直接將外源DNA注射到細胞核或細胞質(zhì)的方法。第七節(jié)重組體的鑒定和分析

陽性重組子的鑒定和篩選①根據(jù)遺傳標記表型特征：抗藥性、α－互補、營養(yǎng)標記；②根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征：大小、酶切圖譜、PCR擴增、核酸分子雜交、DNA測序；③根據(jù)重組子表達產(chǎn)物：免疫分析篩選；一、生物學方法（一）表型篩選法1、雙抗生素篩選法結(jié)合載體上所含有的原核抗藥性標記，利用抗生素和選擇培養(yǎng)基（不完全培養(yǎng)基），十分便于篩選陽性重組子。適用于含>2個的抗性標記的質(zhì)粒。例如pBR322，含Tetr（BamHI位點）和Ampr基因，外源DNA插入，使Tetr滅活。用分別含Ampr

和Tetr的平皿同時篩選，可鑒定出重組子。2、β－半乳糖苷酶篩選法a–互補（a-

complementation）某些質(zhì)粒（如PUC系列），含有大腸桿菌的lacZ基因片段，在該基因區(qū)又有MCS，這些質(zhì)粒將導入lacZ-的宿主菌中表達。

如果無外源基因插入：則質(zhì)粒lacZ基因正常表達和宿主菌的lacZ基因互補，產(chǎn)生有活性的β–半乳糖苷酶，經(jīng)IPTG誘導后，分解X-gal底物，產(chǎn)生blueclony。

如果有外源基因插入：則質(zhì)粒編碼的lacZ基因失活、菌體不可能互補產(chǎn)生β–半乳糖苷酶，產(chǎn)生whiteclony。a–互補篩選重組體示意圖3、營養(yǎng)標記篩選法例如酵母人工染色體上的TRP1HURA3基因，分別是酵母色氨酸和尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型trp1-和ura3-的野生型等位基因，在相應的缺陷型酵母細胞中作為選擇標記；（二）噬菌斑形成篩選法：含有外源基因的噬菌體載體可以形成噬菌斑，反之不能。（三）遺傳互補法——利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞利用表達產(chǎn)物與宿主細胞中營養(yǎng)缺陷突變發(fā)生互補。（四）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞二、核酸分子雜交：1、原理：利用序列互補的單鏈DNA和RNA可利用堿基配對產(chǎn)生氫鍵而形成雜交分子的特性，檢測核酸分子中特異性序列的存在。2、類型：菌落原位雜交；DNA印跡分析；RNA印跡分析；斑點雜交和狹縫雜交；

三、免疫學方法用表達產(chǎn)物的抗血清或McAb進行篩選

四、PCR技術

針對插入重組體中的目的基因，設計一對引物，進行菌落PCR，如能擴增出條帶，則為陽性克隆。

五、酶切鑒定

挑選單個菌落—擴大培養(yǎng)—小量快速提取質(zhì)?！盖校ǜ鶕?jù)插入片段上的酶切位點選定）—分析有無插入片段、插入片段大小及數(shù)量、插入方向等。

六、序列分析－雙脫氧終止法測序（Sanger法）鏈末端終止法的原理：P3541、利用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在四組互相獨立的反應體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸作為鏈反應終止劑，根據(jù)堿基配對原則，在測序引物引導下，合成四組有序列梯度的互補DNA鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影檢測后識讀待測DNA序列。2、引入雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑，2ˊ,3ˊ-ddNTP與普通的dNTP不同之處在于其3ˊ位又少了個羥基。其5’Pi可以和多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但3’不能再與下一個核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止于ddNTP。3、如果在DNA的合成反應中，在4種正常的dNTP之外，再加入一種少量的ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，所以反應產(chǎn)物是一系列長短不一的核苷酸鏈。4、在4組獨立的DNA合成反應中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個A、G、C、T的位置上。對這4組核苷酸鏈同時進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列序列測定Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。

第八節(jié)克隆基因的表達一、表達系統(tǒng)分類（一）按克隆基因與受體細胞不同組合分為4類1.原核基因在原核細胞中表達，例基因工程生產(chǎn)各類工具酶2.原核基因在真核細胞中表達，如β-gal在昆蟲細胞中表達3.真核基因在原核細胞表達，如IL-2,INF-γ等4.真核基因在真核細胞表達，如人β-干擾素和α-干擾素在昆蟲細胞中表達，α-干擾素在小鼠細胞表達（二）按受體細胞表達類型分2類1、原核細胞表達系統(tǒng)（大腸桿菌、枯草桿菌等）2、真核細胞表達系統(tǒng)（酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞）二、克隆基因在大腸桿菌中的表達（一）困難1、缺乏E.coliRNA聚合酶識別的啟動子2、無SD序列，不能與E.coli核糖體小亞基16srRNA結(jié)合，不能翻譯3、真核基因較大，有內(nèi)含子，原核生物無剪接內(nèi)含子的功能4、

原核細胞缺乏真核細胞特有的蛋白修飾系統(tǒng)5、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解

6、原核細胞無法切除信號序列等結(jié)構(gòu)。

（二）構(gòu)建策略：一）目的基因：表達真核基因必須克隆cDNA片段,表達分泌蛋白必須去除真核信號肽序列,ATG的5’端非編碼區(qū)必須去除二）載體選擇：必須是大腸桿菌的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。商用載體已含P和SD序列，無須構(gòu)建。

啟動子的條件：轉(zhuǎn)錄效率高和可調(diào)控

PL、tac、T7啟動子能滿足上述要求三）目的基因和載體的連接

1.產(chǎn)生非融合蛋白時目的基因與載體的連接方式：例如pRSET載體的SD序列3端下游適當位置構(gòu)建的NdeI(CATATG)位