酶分子修飾壓縮課件

第六章酶分子修飾教案酶分子修飾的意義穩(wěn)定酶的天然構(gòu)象保護活性部位維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性降低酶的抗原性改變酶學性質(zhì)回本章目錄第一節(jié)酶的化學修飾化學修飾：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質(zhì)），進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。即利用修飾劑所具有的各種化學基團特性，直接或經(jīng)過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團）產(chǎn)生化學反應(yīng)，對酶分子結(jié)構(gòu)進行改造。一、化學修飾分類（一）酶分子主鏈修飾（二）酶分子側(cè)鏈基團修飾（三）大分子結(jié)合修飾（四）氨基酸置換修飾（五）金屬離子置換修飾（六）親和修飾1、主鏈切斷修飾主鏈切斷的三種情況：活性中心破壞——失活活性中心完整——保持活性，改變抗原性有利于活性中心的形成——顯示活性或活力提高胃蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活2、主鏈連接修飾將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個酶分子具有兩種或多種催化活性。（二）酶分子側(cè)鏈基團修飾酶蛋白的側(cè)鏈基團：指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。包括：氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等。氨基修飾使酶分子側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物，稱為氨基修飾劑修飾劑:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：賴氨酸等羧基修飾劑可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基發(fā)生反應(yīng)的小分子化合物稱為羧基修飾劑。修飾劑:碳化二亞胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天門冬氨酸、谷氨酸等常見基團的化學修飾反應(yīng)：羧基教案巰基修飾劑兩個巰基可以形成二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由于巰基具有很強的親核性，巰基一般是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團。修飾劑：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽等胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個強堿性的胍基，很難被修飾，而一些二羰基化合物能夠在中性或弱堿性條件下與精氨酸反應(yīng)，目前關(guān)于精氨酸的修飾的研究主要集中在二羰基化合物上。常見基團的化學修飾反應(yīng)：胍基教案酚基修飾劑蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚基。修飾方法：碘化法、硝化法等修飾劑：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。咪唑基修飾組氨酸含有咪唑基，咪唑基多為酶活性中心的必須基團修飾劑：碘乙酸、焦炭酸二乙酯常見基團的化學修飾反應(yīng)：咪唑基教案分子內(nèi)交聯(lián)修飾含有雙功能基團的化合物（雙功能試劑）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距較近的兩個基團之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法（三）酶的大分子修飾采用水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(共價)結(jié)合使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法非共價修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。如多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白質(zhì)。用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。共價修飾大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。應(yīng)用最廣的修飾劑聚乙二醇是線性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無抗原性，分子末端有可活化的羥基，活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾?？捎枚喾N不同試劑活化，修飾不同基團聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亞胺聚乙二醇馬來酸酐、聚乙二醇胺將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法稱為氨基酸置換修飾(四)氨基酸置換修飾氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學修飾方法例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

1.化學修飾方法氨基酸置換2.定點突變法氨基酸置換現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術(shù)。定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。定點突變過程1、酶分子結(jié)構(gòu)設(shè)計（根據(jù)已知的酶結(jié)構(gòu)和其存在的問題）2、突變基因序列的確定（考慮物種差異）3、突變基因的獲得（DNA合成儀＋PCR）4、新酶的獲得（重組、轉(zhuǎn)入宿主、表達）（五）金屬離子置換修飾1、概念2、作用范圍3、常用金屬離子4、方法步驟1、概念通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。2、作用范圍含有金屬離子的酶金屬酶特點：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會失活，重新加入原離子則酶復活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。3、常用金屬離子（往往是二價離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。4、金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。（六）親和修飾親和標記是一種特殊的化學修飾方法，它利用酶與底物的親和能力，使用與底物或配體結(jié)構(gòu)類似的修飾劑，對酶活性中心上的氨基酸殘基進行共價修飾修飾。二、酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大?；乇菊履夸泜?cè)鏈基團修飾的主要作用1.研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。2.測定某一種基團在酶分子中的數(shù)量3.提高酶活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性、引起酶的催化特性和催化功能的改變4.獲得自然界原來不存在的新酶種5.用于酶蛋白分子的固定化大分子結(jié)合修飾的效果提高酶活力——結(jié)合后酶空間構(gòu)象的改變使活性中心更有利于和底物結(jié)合，形成催化部位例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍增強酶的穩(wěn)定性——空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，活性中心得到保護降低或消除酶的抗原性——分子結(jié)構(gòu)的改變使抗體不能識別提高抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。三、化學修飾方法的幾個問題

決定化學修飾成敗的關(guān)鍵是修飾的專一性，盡量少破壞必需基團，得到高的酶活力回收。為此，有時需要通過反復試驗來確定。其中：對酶性質(zhì)的了解：活性部位、穩(wěn)定條件、反應(yīng)最佳條件及側(cè)鏈基團性質(zhì)等；選擇修飾劑考慮：1）分子量、修飾劑鏈長和對蛋白吸附性；2）修飾劑上反應(yīng)基團的數(shù)目及位置；3）修飾劑上反應(yīng)基團的活化方法和條件（一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應(yīng)活性基團）；選擇酶反應(yīng)條件要注意：1）反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、PH、溫度、時間；2）酶與修飾劑的比例。參考：酶工程P.86(一)、試劑的選擇—要根據(jù)修飾目的選擇例如對氨基修飾可有幾種情況——修飾所有氨基而不修飾其它基團；僅修飾-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基；修飾具有催化活性的氨基；用于修飾酶活性部位氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備：選擇性地與一個氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性條件下進行；修飾反應(yīng)的程度能簡單測定；(二)、反應(yīng)條件的選擇不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性（通過對照實驗）；有利于專一性修飾（小心控制條件，盡可能在酶蛋白特定構(gòu)象不變或少變的情況下進行）；溫度、pH、反應(yīng)介質(zhì)和緩沖液；在所有影響化學修飾的反應(yīng)條件中,pH值是最重要的一個條件,因為它決定了具有潛在反應(yīng)能力的功能基團所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的解離狀態(tài)。一般情況下,增加pH可以提高反應(yīng)速率,降低pH可以減小反應(yīng)速率。反應(yīng)活性較高的修飾劑可以在生理pH下與蛋白質(zhì)耦合;而反應(yīng)活性較低的修飾劑通常需要較高的pH。修飾反應(yīng)的專一性則對應(yīng)有一個優(yōu)化pH值。(三)、反應(yīng)的專一性

除考慮修飾試劑專一性、控制反應(yīng)條件外，還可利用其它途徑來實現(xiàn)修飾專一性：親和標記試劑（如甲基苯磺酰氟作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上）差示標記（在底物或抑制劑存在下進行化學修飾利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異（如在結(jié)晶狀態(tài)下反應(yīng)）四、酶化學修飾的應(yīng)用

在醫(yī)藥方面：化學修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長它在體內(nèi)半衰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術(shù)領(lǐng)域：化學修飾酶能夠提高酶對熱，酸，堿和有機溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學性質(zhì)。

在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：1.研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。五、酶蛋白化學修飾的局限性1.某種修飾劑對某一氨基酸側(cè)鏈的化學修飾專一性是相對的，很少有對某一氨基酸側(cè)鏈絕對專一的化學修飾劑。2.化學修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象的變化將妨礙對修飾結(jié)果的解釋。3.酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進行，目前還不能用化學修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用。4.酶化學修飾的結(jié)果對于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性所“必需”的，為什么是必需的，還得用X射線和其他方法來確定。因此化學修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準確性和系統(tǒng)性。第二節(jié)酶分子的物理修飾通過物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。變性、誘導與構(gòu)象重建

（對酶高級結(jié)構(gòu)調(diào)整）酶肽鏈變性松散后，使其在有底物類似物或抑制劑存在的非天然條件下復性，酶將折疊成所需要的特殊結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的性狀，此即變性誘導構(gòu)象重建的原理。

實驗證據(jù)：在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理天然Rnase（核糖核酸酶）,其二硫鍵全部斷裂，肽鏈松散，活性全部喪失，但當用透析法除去尿素、巰基乙醇后，RNase活力全部恢復，而且復原后產(chǎn)物其物化性質(zhì)與天然RNase完全相同。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程和酶的定向進化

（基因水平上進行蛋白質(zhì)改造）一、酶蛋白質(zhì)工程酶作為生物催化劑的應(yīng)用和發(fā)展,主要取決于其成本和功能。從天然產(chǎn)物中直接分離獲取有應(yīng)用價值的酶,其來源就局限于為數(shù)不多的低成本天然產(chǎn)物。性能更好的酶,如果是來源于生產(chǎn)性能差的微生物則難以利用,更談不上其他高等生物的酶的利用。教案引言基因重組技術(shù)的應(yīng)用是酶技術(shù)的又一革命性突破。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),目的蛋白的基因拷貝可以數(shù)十倍地增加,幾乎可以達到微生物體系生產(chǎn)蛋白的極限,使得酶的生產(chǎn)成本又一次飛躍性地下降。更重要的是,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在理論上使得幾乎所有來源的酶的生產(chǎn)成為了可能,而在實踐上也實現(xiàn)了相當多數(shù)來源的酶的人工生產(chǎn)。酶的選擇不再決定于其來源,而在于其性能。教案引言蛋白質(zhì)工程——以重組DNA技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合X-衍射分析技術(shù)、蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象理論及計算機輔助設(shè)計發(fā)展起來的一種定點定位修飾技術(shù)體系，也是在基因水平進行蛋白質(zhì)改造的技術(shù)科學。一、酶蛋白質(zhì)工程（一）概述1、蛋白質(zhì)工程的主要目標2、酶蛋白質(zhì)工程所需基本信息3、酶蛋白質(zhì)工程的流程4、酶蛋白質(zhì)工程的前景教案引言1、蛋白質(zhì)工程的主要目標(1)功能的改變(2)結(jié)構(gòu)特性的改變(3)新體系的創(chuàng)造蛋白質(zhì)工程的主要目標(1)功能的改變提高Vm,減小km，改變最適pH,去除抑制部位,改變催化反應(yīng)的特異性,去除影響穩(wěn)定性的殘基。(2)結(jié)構(gòu)特性的改變提高熱穩(wěn)定性,提高在有機溶劑中的穩(wěn)定性,改變物理化學特性,改變配位體的結(jié)合特異性。(3)新體系的創(chuàng)造雜化和多功能酶,添加便于分離的片斷,改進治療用酶的有效性。

教案引言2、酶蛋白質(zhì)工程所需基本信息

酶的基因克隆;該基因的序列;活性部位的作用機理,更理想的是涉及活性部位的氨基酸;酶的晶體結(jié)構(gòu),或者至少是同源性很高的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。3、酶蛋白質(zhì)工程的流程相關(guān)的序列及3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫4、酶蛋白質(zhì)工程的前景酶的蛋白質(zhì)工程是典型的多學科綜合研究,所涉及的學科不僅有酶學、蛋白質(zhì)化學和分子生物學,而且還涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析和生物信息學分析。在對于天然的蛋白分子的研究還未總結(jié)出可以基本涵蓋絕大多數(shù)情況的結(jié)構(gòu)與功能的規(guī)律之前,酶的蛋白質(zhì)工程不可能成為主要的創(chuàng)造新酶源的手段。酶的蛋白質(zhì)工程將創(chuàng)造出大量具有新的、功能更好的酶產(chǎn)品，蛋白質(zhì)工程對于分子性能的改善程度和功能創(chuàng)新的多樣性,將會超過現(xiàn)在最具想像力的預測。（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)所具有的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)

,因此對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究在蛋白質(zhì)工程中有著極其重要的意義。蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息,以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫,為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定1）一級結(jié)構(gòu)測定2）三維結(jié)構(gòu)測定3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類1）一級結(jié)構(gòu)測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定是蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)測定的前提,其基本步驟是:①應(yīng)用化學裂解法或蛋白酶水解法將多膚鏈專一性裂解

,得到一系列肽段;②逐一測定每個純化的小肽段的順序;③根據(jù)肽段氨基酸順序中的重疊區(qū)確定小肽段的排列次序;④完成整條多肽鏈的順序分析。2）三維結(jié)構(gòu)測定測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法主要有兩類:①蛋白質(zhì)晶體X線衍射法;②多維磁共振法。

①蛋白質(zhì)晶體X線衍射法X線衍射法是迄今為止研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)最有效的方法,所能達到的精度是任何其他方法所不能比擬的。它的缺點是蛋白質(zhì)的晶體較難培養(yǎng)、晶體結(jié)構(gòu)測定的周期較長。0.5nm分辨率

0.3nm分辨率

0.2nm分辨率

0.15nm分辨率0.5nm分辨率

0.3nm分辨率

0.2nm分辨率

0.15nm分辨率②多維磁共振法多維磁共振法近年來發(fā)展較快,可以直接測定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象,但對樣品的需要量大、純度要求高,被測定的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量一般不超過20000,因此其應(yīng)用也受到很大限制。3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類大量蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的測定使得有可能對蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)分類。目前一般將蛋白質(zhì)按照空間結(jié)構(gòu)分成如下幾類：①只含α—螺旋,如血紅蛋白;

②只含β—折疊,如過氧化物歧化酶;

③既有α—螺旋,又有β—折疊,又可分為兩類α/β類:α—螺旋和β—折疊交替出現(xiàn),如黃素氧化還原蛋白;α+β類：α一螺旋和β—折疊彼此不相關(guān),如天花粉蛋白。其中,以第三類為最多。2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能,因此如何獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并對其分析研究是現(xiàn)代分子生物學的重要課題。從遺傳信息到最后的遺傳物質(zhì)的表達即具有活性的蛋白質(zhì),可以說包含兩組密碼,從DNA到蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),再從一級結(jié)構(gòu)到空間結(jié)構(gòu)。1）預測二級結(jié)構(gòu)的方法預測二級結(jié)構(gòu)的方法主要有以下幾種:①經(jīng)驗預測法②概率預測法③立體化學預測法由于目前對二級結(jié)構(gòu)中氨基酸的中遠程相互作用不完全清楚,因此預測準確率一般在65%以下。2）蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的最終目標主要有兩個方向:①根據(jù)二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)類型和折疊類型預測的結(jié)果,結(jié)合結(jié)構(gòu)間的立體化學性質(zhì)、親疏水性質(zhì)、氫鍵以及靜電相互作用,把可信度較高的二級結(jié)構(gòu)進一步組裝

,搭建出最后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);②不依賴二級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果,直接預測三維結(jié)構(gòu)。(1)同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測通過對類似蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)更加保守,氨基酸殘基序列有50%相同的蛋白質(zhì),約有90%Cα原子偏差不超過3A,均方根偏差約1A。若待測模型構(gòu)建蛋白質(zhì)的序列與模板序列經(jīng)比對后的序列同源性在40%(也有人認為在35%）以上,則它們的結(jié)構(gòu)可能屬于同一家族,是同源蛋白,可以用同源蛋白模型構(gòu)建的方法預測其三維結(jié)構(gòu)。因為它們可能是由同二種蛋白質(zhì)分化而來,具有相似的空間結(jié)構(gòu),相同或相近的功能。教案引言因此,若知道了同源蛋白家族中某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),就可以預測其他一些序列已知而結(jié)構(gòu)未知的同源蛋白的結(jié)構(gòu),可以用同源模型構(gòu)建的方法預測未知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。它的基本原理是根據(jù)同源結(jié)構(gòu)中的保守部分搭建出未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)骨架。這是目前最成熟的預測方法,并已有商業(yè)化軟件可以使用。自從Blurldell等人于20世紀80年代末提出同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測以來,已有許多此類結(jié)構(gòu)預測的報道。教案引言(2)反向折疊法蛋白質(zhì)反向折疊又稱蛋白質(zhì)逆折疊。反向折疊法的主要原理是把未知蛋白質(zhì)的序列和已知的結(jié)構(gòu)進行匹配，找出一種或幾種匹配最好的結(jié)構(gòu)作為未知蛋白質(zhì)的預測結(jié)構(gòu)。然后經(jīng)過對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫的學習總結(jié)，得出可以區(qū)分正誤結(jié)構(gòu)的平均勢函數(shù)，以此來選擇最佳的匹配方式。二、定向進化定向進化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。試管中的進化是生物工程的未來

——諾貝爾獎金獲得者

M.Eigen1、定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+定向選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當于環(huán)境，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的。3、定向進化不是定點突變定向進化：突變篩選

突變位點是隨機的，不確定的；突變位點的數(shù)目也是不確定的；突變的效應(yīng)更是不可預知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學的，生物的）都可以應(yīng)用于定向進化中突變體的產(chǎn)生。定點突變：

突變位點是確定的，突變的個數(shù)也是預知的；突變的效應(yīng)可能是已知的，也可能是未知的；定點突變的方法一般是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的。教案4、定向進化與自然進化的異同定向進化的實質(zhì)是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。定向進化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進化，使進化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同：進化動力不同：進化方向不同：進化速度不同：

進化目標不同：教案5、酶體外定向進化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。酶的體外定向進化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。（二）隨機突變的策略易錯PCR技術(shù)(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuflling)隨機引發(fā)重組交錯延伸技術(shù)教案

PCR技術(shù)的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術(shù)的革命美國Mullis教授開汽車時的聯(lián)想

逶迤崎嶇的山路——DNA雙螺旋行駛的汽車——一小段DNA引物

……

1985年發(fā)明了PCR技術(shù)

1993年獲得諾貝爾獎1.聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）教案PCR技術(shù)的原理

多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）的原理類似于DNA的天然復制過程，在待擴增DNA片段的兩側(cè)與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。教案聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀教案

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合變性引物退火教案

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）每一輪聚合酶鏈式反應(yīng)可使目的基因片段增加一倍延伸第二輪擴增

循環(huán)延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈教案聚合酶鏈反應(yīng)(d)更多輪反應(yīng)擴增的片段呈指數(shù)增長30個循環(huán)后產(chǎn)生228=268435456個片段(e)產(chǎn)物的可視化PCR產(chǎn)物DNA大小標準物瓊脂糖凝膠教案PCR實驗的基本步驟：(1)94℃模板DNA變性(2)50～60℃寡核苷酸引物的退火(3)72(或74℃)新的DNA合成(4)重復循環(huán)30-35次PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)就是在體外快速擴增特定基因或DNA序列的一種方法。教案設(shè)定正確的溫度變性(1min)退火(1min)延伸(2min)教案溫度對引物和模板的雜交有重要影響(a)退火溫度太高(a)退火溫度太高(b)退火溫度太低引物與模板仍相互分離錯誤雜交–

不是所有引物與模板形成正確教案(c)合適的退火溫度溫度對引物和模板的雜交有重要影響引物僅與模板上期望的目的位點相接合教案用設(shè)計的質(zhì)量不同的引物擴增出來的PCR產(chǎn)物Lane1:goodLane2:nothingLane3:wrongsizeLane4:mixture教案2、易錯PCR易錯PCR（errorpronePCR）是指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導致目的基因隨機突變。連續(xù)易錯PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變。教案3、DNA改組DNA改組（DNAshuffling）有譯為DNA“洗牌”又稱有性PCR(sexualPCR)。首先利用DNA聚合酶的錯配進行錯誤導向PCR產(chǎn)生隨機突變子庫,用NaseⅠ或各種限制性內(nèi)切酶消化父本基因,產(chǎn)生適當大小的片段,這些片段再經(jīng)重新裝配、擴增形成的突變文庫具有更大的多樣性。(這一步可以反復進行多次),再擴增和克隆帶有多點突變的基因,最后篩選期望的重組子。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。教案DNAshuffling采用DNAshuffling枯草桿菌蛋白酶的抗熱性提高了17℃,65℃的耐熱時間提高了200多倍。教案4、外顯子改組外顯子改組（exonshuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進行交換，外顯子改組尤其適用于真核生物。不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。教案5、體外隨機引發(fā)重組

體外隨機引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。教案6、交錯延伸

交錯延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復進行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。教案7、隨機片段交換該方法主要由三個步驟組成,即基因破碎;添加隨機短序列;重新組裝。首先常規(guī)PCR擴增待突變基因。接著用DNaseⅠ消化,獲得一系列大小在100～300bp之間的DNA碎片。然后在末端脫氧轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,DNA碎片的3‘末端被隨意加上一個至幾個堿基。隨后這些帶3’尾巴的短片段互為引物進行PCR重新組裝。最后加入兩端引物擴增出全長基因。教案（三）突變庫的高通量篩選創(chuàng)建基因突變庫的方法目前已有很多,但是建立起來的突變庫的容積普遍比我們有能力篩選的蛋白數(shù)量要高出幾個數(shù)量級。此外,創(chuàng)建基因突變庫的方法比較通用,但是對于酶活性篩選卻必須針對不同的酶和反應(yīng)制定不同的篩選方法。定向進化的最大瓶頸是缺乏通用的高通量的篩選方法,或比較通用的針對目標活性的選擇方法。所以高通量篩選日益受到人們的重視。教案1、定向進化的選擇策略（1）定向進化中，突變具有隨機性，但通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。（2）通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。教案目前,傳統(tǒng)的有效篩選方法大多是采用