微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)課件

第二章微生物的純培養(yǎng)

和顯微技術(shù)第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)

第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)第三節(jié)顯微鏡下的微生物微生物特點培養(yǎng)物（culture）:指在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體。純培養(yǎng)物（pureculture）：微生物學(xué)中把從一個細胞或一群相同的細胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代，稱純培養(yǎng)。所得培養(yǎng)物成為純培養(yǎng)物。有關(guān)概念第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)

一、無菌技術(shù)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)(常用稀釋法)四、單細胞（孢子）分離五、選擇培養(yǎng)分離六、微生物的保藏技術(shù)1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌

火焰灼燒法干熱滅菌法烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法高溫滅菌巴氏消毒法常壓下煮沸消毒法間歇滅菌法濕熱滅菌法常規(guī)加壓滅菌法加壓下連續(xù)加壓滅菌法2、接種操作接種工具：白金or鎳鉻合金接種針/環(huán)操作環(huán)境：

超凈工作臺二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進行多次平行劃線，使微生物細胞分開生長以獲得微生物純培養(yǎng)的過程。3、涂布平板法（spreadplate）

先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。傾注平板法涂布平板法

先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。稀釋搖管法--------稀釋倒平板法的一種變通形式三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)(常用稀釋法)四、單細胞（孢子）分離

采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞分離法。

這種方法對操作技術(shù)要求較高，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中使用。采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進行。毛細管法：用毛細管提取微生物個體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細胞的液滴來進行純培養(yǎng)物的分離。五、選擇培養(yǎng)分離六、微生物的保藏技術(shù)菌種保藏方法連續(xù)移接改變條件（干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）使菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保藏，有的可保藏幾十年或更長的時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。

1、傳代培養(yǎng)保藏是微生物保存的基本方法。瓊脂斜面、半固體瓊脂柱和液體培養(yǎng)等。橡皮塞封口或用石蠟覆蓋，并放置低溫保存。4℃保存。2、冷凍保藏

代謝作用停止。細胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細胞壁者則比有細胞壁敏感。其原因是低溫會使細胞內(nèi)水分形成冰晶，從而引起細胞，尤其是細胞膜的損傷。速凍及快速解凍可減少損傷；還可加一些保護劑，如0.5%左右的甘油或二甲亞砜可透入細胞，并通過降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質(zhì)因此在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加入各種保護劑以提高培養(yǎng)物的存活率。3、干燥保藏法

沙土管保存和冷凍真空干燥保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。沙土管保存

一般將菌種接種至斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸浮液，加入無菌沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、橡膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等，保藏時間相對較長。冷凍真空干燥保藏

是將加有保護劑的細胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過水的升華作用除去水分。達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達到長期保藏的目的。用水升華的方式除去水分，手段比較溫和，細胞受損傷的程度相對比較小，存活率及保藏效果均不錯，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)一、顯微鏡的種類及其原理二、顯微觀察樣品的制備三、顯微鏡下的微生物分辨率:指能辨別兩點之間最小距離的能力。

反差:指樣品區(qū)別于背景的程度。波長與分辨率

分辨率(最小可分辨距離)=0.5λ∕nsinθ=λ∕2NA一、顯微鏡的種類及原理

1.普通光學(xué)顯微鏡(復(fù)式顯微鏡)

機械裝置:鏡座、支架、載物臺、調(diào)焦螺旋等光學(xué)系統(tǒng):物鏡、目鏡、聚光鏡等

使用油鏡時加鏡油的目的:

(1)增加照明亮度(2)增加顯微鏡的分辨率

光學(xué)顯微鏡2.暗視野顯微鏡

主要用于觀察

生活細菌的運動性。3.相差顯微鏡

通過環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差(明暗差)，從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強。4.

熒光顯微鏡在紫外線的照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體。

5.透射電子顯微鏡(TEM)

6.掃描電子顯微鏡(SEM)

7.掃描隧道顯微鏡(STM)

二、顯微觀察樣品的制備1、光學(xué)顯微鏡的制樣(1)活體觀察①壓滴法將菌懸液滴于載玻片上,加蓋蓋玻片后立即進行顯微鏡觀察。②懸滴法在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上后進行顯微鏡觀察。③菌絲埋片法將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面,涂布放線菌或霉菌孢子懸液,經(jīng)培養(yǎng)取下玻璃紙置于載玻片上,用顯微鏡對菌絲的形態(tài)進行觀察。特點:可以避免一般染色制樣時的固定作用對微生物細胞結(jié)構(gòu)的破壞,并可用于專門研究微生物的運動能力、攝食特性及生長過程中的形態(tài)變化。(2)染色觀察

染色前固定樣品的目的:①殺死細菌并使菌體黏附于玻片上；②增加其對染料的親和力。常用酒精燈火焰加熱和化學(xué)固定兩種方法。第三節(jié)顯微鏡下的微生物

不同光鏡照片(用四種不同技術(shù)制得的纖毛蟲)a:明視野顯微鏡;b:暗視野顯微鏡;c:相差顯微鏡;d:Nomarski顯微鏡微分干涉相襯顯微鏡光鏡照片(啤酒酵母屬面包酵母細胞)a:明視野顯微鏡

b:相差顯微鏡

c:暗視野顯微鏡光鏡照片(正在大量繁殖面包酵母細胞)a:明視野顯微鏡

b:暗視野顯微鏡光鏡照片(纖毛蟲的活細胞)a:明視野顯微鏡(x100);

b:暗視野顯微鏡(x110);

c:相差顯微鏡(x100)

光鏡照片(a:兩端生鞭毛的大腸桿菌;暗視野顯微鏡;b:紫色紅螺菌;相差顯微鏡)＃電鏡照片(淋巴細胞)

(a:透射電鏡;淋巴細胞薄片二維內(nèi)部結(jié)構(gòu);

b:掃描電鏡;三維表面結(jié)構(gòu))電鏡與光鏡照片(正在進食的纖毛蟲)一、填空1、無菌技術(shù)包括__________、___________無菌和__________技術(shù)。2、最常用的滅菌方法有__________、__________和___________等。3、純種分離方法通常用__________、___________、_____________、___________，其中，要測定食品中細菌的總數(shù)時，被測樣品加入培養(yǎng)皿時應(yīng)采用____________方法。4、通常采用____________和____________方法來分離自然界中混雜微生物中只占少數(shù)的特定有用微生物，其原理是根據(jù)________________________。5、微生物菌種保藏的原理是在____________、____________、____________、__________、____________等環(huán)境條件下，使其處于代謝不活潑狀態(tài)。6、____________和____________是決定顯微觀察效果的一個重要因素，而____________又是決定物鏡性能的最重要指標(biāo)。7、顯微技術(shù)除了顯微鏡的特性外，還取決于____________、____________和____________。8、用油鏡觀察時，需在載玻片與鏡頭之間加滴____________，其作用___________和____________。二、是非題1、光學(xué)顯微鏡的分辨率與所用波長所正比。

（

）2、熒光顯微技術(shù)原理是在紫外光的照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體。（

）3、明視野顯微鏡觀察到的微