細(xì)胞工程基本技術(shù)課件

第三章細(xì)胞工程基本技術(shù)一、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

1動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

無(wú)菌操作室：更衣間、緩沖間、操作間培養(yǎng)觀察室制備室儲(chǔ)藏室清洗與滅菌室

2植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置除與動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室相同的設(shè)置外，還有些特殊要求，如光照、試管苗培育和移植馴化等。細(xì)胞記數(shù)板和電子細(xì)胞記數(shù)儀過(guò)濾除菌裝置離心機(jī)移液管、吸管離心管移液器天平動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)備儀器

1培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱，提供恒定CO2（5%）以穩(wěn)定pH值，溫度：哺乳類35℃-37℃，鳥(niǎo)類38.5℃，氣相：O2、CO2、pH7.2-7.42顯微操作儀

3細(xì)胞融合儀

4細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器（程序化冷凍儀和液氮罐-196℃）5培養(yǎng)用器皿各種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板（6、24、96）6手術(shù)器械等三、實(shí)驗(yàn)室的生物安全

根據(jù)密封程度的不同,將生物安全分為四個(gè)等級(jí),即:P1、P2、P3、P4（protect）一般細(xì)胞培養(yǎng)按一級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)，其基本要求是：

1、限制隨便出入實(shí)驗(yàn)室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液體；4、禁止在室內(nèi)進(jìn)食、吸煙和存放食品；5、操作時(shí)著專門(mén)實(shí)驗(yàn)服；6、處理細(xì)胞前后要洗手；7、操作時(shí)在超凈工作臺(tái)。四、培養(yǎng)用品的清洗在培養(yǎng)物中無(wú)毒和無(wú)菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件，因此對(duì)培養(yǎng)器皿的清洗和滅菌是極為重要的環(huán)節(jié)。清洗的目的是清除雜質(zhì)和微生物,使器皿內(nèi)不殘留任何影響細(xì)胞生長(zhǎng)的成分(有害物質(zhì)、微生物、細(xì)胞碎片及非營(yíng)養(yǎng)性化學(xué)成分）。①浸泡初次使用和培養(yǎng)用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。培養(yǎng)后的玻璃器皿多附有大量蛋白質(zhì)，用完后應(yīng)立即初步刷洗，浸泡在蒸餾水中，注意讓水完全進(jìn)入瓶皿中，不要留有氣泡。使用新的器皿應(yīng)先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用稀鹽酸(5％)浸泡過(guò)夜或煮沸30分鐘，中和其中的堿性物質(zhì)后再清洗。②刷洗浸泡后的玻璃器皿要用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑（加熱）刷洗。

③浸酸刷洗不掉的極微量雜質(zhì)經(jīng)過(guò)清洗液浸泡的強(qiáng)氧化作用可被除掉。清洗液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，去污十分有效，是清洗過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。清洗液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和水按一定比例配制而成。浸泡時(shí)器皿要充滿洗液，不留氣泡。浸泡時(shí)間不應(yīng)少于6小時(shí)，一般應(yīng)浸泡過(guò)夜。

清洗液可根據(jù)需要，配制成不同強(qiáng)度：常用的有下面三種：強(qiáng)液：重鉻酸鉀63g，濃硫酸1000ml，蒸餾水200ml次強(qiáng)液：重鉻酸鉀120g，濃硫酸200ml，蒸餾水1000ml弱液：重鉻酸鉀l00g，濃硫酸l00ml，蒸餾水1000ml

配制時(shí)先將重鉻酸鉀完全溶解于水，然后緩慢加入濃硫酸。新配制的清潔液為棕紅色，經(jīng)多次使用，水份增多或遇有機(jī)溶劑時(shí)成為綠色，這時(shí)表示清潔液已失效，應(yīng)廢棄而重新配置。

也可以使用10％～40％的硝酸溶液。2、橡塞清洗新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗。膠塞類橡膠用品，每次用后先用蒸餾水浸泡，然后用2％NaOH煮沸10-20min，用自來(lái)水沖洗干凈，再用1％稀鹽酸浸泡30min，用自來(lái)水沖洗、蒸餾水漂洗2-3次，最后雙蒸或三蒸水漂洗1次，晾干后備用。3、塑料器皿的清洗細(xì)胞培養(yǎng)使用的塑料器皿主要有培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品主要是進(jìn)口的一次性商品，己消毒滅菌，打開(kāi)就可使用。如想反復(fù)使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脫脂棉清拭掉殘留附著物，用2％NaOH浸泡過(guò)夜，流水沖凈后再用5％鹽酸浸泡30min，自來(lái)水沖洗、蒸餾水漂洗2~3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干備用。五、消毒滅菌防止細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染。消毒滅菌的方法有多種，隨物品不同，采用不同的方法。總的來(lái)說(shuō)有物理方法和化學(xué)方法兩大類。物理法包括：濕熱(高壓蒸氣)、干熱、過(guò)濾和紫外線等方法殺滅或去除微生物。化學(xué)法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。３、濕熱滅菌濕熱滅菌即高壓蒸氣滅菌，是最常用和最有效的一種方法。布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿及某些培養(yǎng)用液都可用此法消毒滅菌。各種物品有效消毒滅菌壓力和時(shí)間不同，一般培養(yǎng)用液、橡膠制品要求10磅(114℃)，10～20分鐘或8磅(112℃)30分鐘。布類、玻璃制品、金屬器械等為15磅(12l℃)20分鐘。。４、干熱滅菌主要適用于玻璃器皿的消毒滅菌。用電熱鼓風(fēng)干燥箱加溫到160℃，保持1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，可達(dá)到消毒目的。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱消毒法。灼燒也屬于干熱消毒滅菌方法５、濾過(guò)除菌大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)液、血清、酶溶液等，在高溫下會(huì)變性，失去功能，必須采用濾過(guò)法除菌。玻璃濾器適用于各種培養(yǎng)液的濾過(guò)除菌。玻璃濾器根據(jù)濾板的孔徑分為G1一G6幾種規(guī)格，一般采用G6型(孔徑在1.5μm以下)，可達(dá)到除菌目的。微孔濾膜濾器，應(yīng)選用孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌。各種濾器必須先經(jīng)高壓蒸氣消毒、烤干后方可使用。２、抗生素抗生素主要適用于培養(yǎng)用液消毒滅菌，不同種類抗生素適于殺滅不同微生物，多數(shù)是為了預(yù)防。最常用的抗生素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素等。常規(guī)培養(yǎng)用液抗生素濃度為：青霉素100單位／ml、鏈霉素100單位／m1、慶大霉素50μg／m1或l00μg／m1。六、污染檢測(cè)與控制

污染：一切與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的雜質(zhì)（微生物、化學(xué)物、細(xì)胞等）進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)，影響培養(yǎng)物的正常生理機(jī)能。在眾多的污染源中，微生物是最突出最重要最常見(jiàn)的污染。

(一)微生物污染的途徑空氣、器材、操作、血清和組織樣本等。

3、支原體的污染檢測(cè)與控制支原體的污染是一個(gè)常見(jiàn)而棘手的問(wèn)題，外觀上看不出明顯的變化，實(shí)際上或多或少的影響到細(xì)胞的眾多機(jī)能。目前尚無(wú)有效的防范措施?？赏ㄟ^(guò)支原體培養(yǎng)、PCR及電鏡觀察等方法進(jìn)行檢測(cè)。支原體的去除可采用：41

°C

4、病毒的污染檢測(cè)與控制病毒的污染主要是通過(guò)DNA的整合，改變培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)或干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)病毒的檢測(cè)主要有直接觀察、動(dòng)物接種檢查、電鏡觀察、免疫學(xué)及PCR法。5、細(xì)胞交叉污染及檢測(cè)

在培養(yǎng)的細(xì)胞中混雜有其它細(xì)胞，從而對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)或生長(zhǎng)特性等方面的影響。常采用形態(tài)觀察或檢查細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。

有效防治采取的措施：1）嚴(yán)格操作，器具分明，空間隔離；2）細(xì)胞的取放嚴(yán)禁接觸培養(yǎng)液瓶口；3）對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞要有充足的儲(chǔ)備。

（三）污染的預(yù)防1、培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備(超凈工作臺(tái)的嚴(yán)格護(hù)理)2、培養(yǎng)操作時(shí)的注意事項(xiàng)3、其他注意事項(xiàng)七、無(wú)菌操作技術(shù)（無(wú)菌操作的基本要領(lǐng)和要求）在細(xì)胞培養(yǎng)中防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無(wú)菌，防止污染。為達(dá)到這一要求，所有工作要進(jìn)行得有條不紊和安全可靠。（一）培養(yǎng)前的準(zhǔn)備要充分做好培養(yǎng)前的實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備工作，根據(jù)研究?jī)?nèi)容的要求進(jìn)行物品清點(diǎn)包裝，注明標(biāo)簽后滅菌、烤干備用。在工作前移入超凈工作臺(tái)內(nèi)。（二）培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)的消毒工作面先用新潔爾滅擦拭一遍后，打開(kāi)紫外線燈滅菌，用30W紫外線燈管直接照射20—30分鐘。然后關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)風(fēng)機(jī)。超凈工作臺(tái)要用75％酒精擦拭。培養(yǎng)用液和培養(yǎng)細(xì)胞不能放在紫外線下直接照射，在操作時(shí)隨手?jǐn)y入。

（三）洗手和著裝原則上與外科手術(shù)洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水沖洗，然后用0.2％新潔爾滅或75％灑精棉球擦洗。穿無(wú)菌服，戴無(wú)菌帽和口罩。（四）無(wú)菌培養(yǎng)操作在無(wú)菌條件下操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈，此后一切操作，如安裝吸管橡皮頭、打開(kāi)瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過(guò)火焰燒灼，或在近火焰處進(jìn)行（火焰消毒）。

注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防退火。燒過(guò)的用具要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及器皿的無(wú)菌部分，如已接觸，要更換或用火焰燒灼觸及部。

為拿取方便，工作臺(tái)面上的布局要合理，原則上為右手使用方便的用品放在右側(cè)，左手用品在左側(cè)。培養(yǎng)液等不要過(guò)早開(kāi)瓶，不要長(zhǎng)時(shí)間直立暴露開(kāi)口，以免增加污染機(jī)會(huì)。吸取不同用液時(shí)，均應(yīng)分別使用不同的吸管，以防擴(kuò)大污染或增加混淆不同細(xì)胞的機(jī)會(huì)。

八、顯微技術(shù)各種顯微鏡技術(shù)同細(xì)胞生物學(xué)要掌握原理與應(yīng)用九、細(xì)胞觀察與分析細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，要及時(shí)觀察和了解生長(zhǎng)增殖狀況，包括新生、增殖、消亡等各種狀態(tài)的時(shí)間參數(shù)、細(xì)胞數(shù)量、分布位置等指標(biāo)，以及體外因素對(duì)這些指標(biāo)的調(diào)節(jié)機(jī)制。這屬于細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的研究。廣義的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)還包括其它的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及其原理的研究。（一）細(xì)胞技術(shù)與活力分析1、細(xì)胞計(jì)數(shù)法用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，然后根據(jù)需要進(jìn)行必要的調(diào)整。

2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線是反映培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間與培養(yǎng)細(xì)胞濃度之間關(guān)系的曲線。以時(shí)間（橫坐標(biāo)）對(duì)細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml為縱坐標(biāo)）繪制，反映培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的動(dòng)態(tài)變化。3、有絲分裂指數(shù)的測(cè)定

在一群細(xì)胞中，進(jìn)入分裂期細(xì)胞所占該群細(xì)胞的百分率，即為有絲分裂指數(shù)。它反映了細(xì)胞增殖的速度。

分裂細(xì)胞數(shù)分裂指數(shù)=×100%

細(xì)胞總數(shù)4、細(xì)胞貼壁率又稱接種存活率，貼壁附著生長(zhǎng)的細(xì)胞狀況直接反映細(xì)胞的生存能力。5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞周期各時(shí)相控制并按一定的時(shí)間順序予以表達(dá)的，而細(xì)胞周期各時(shí)相的分析，特別是細(xì)胞周期及其各時(shí)相時(shí)長(zhǎng)的測(cè)定對(duì)于研究細(xì)胞群體的生長(zhǎng)行為，尤其是對(duì)于包括DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂在內(nèi)的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)控制的研究，無(wú)疑是一個(gè)很重要的前提。

基本步驟細(xì)胞培養(yǎng)消化細(xì)胞計(jì)數(shù)種植60mm培養(yǎng)皿（70X104

個(gè)細(xì)胞/皿）藥物處理細(xì)胞收細(xì)胞（胰蛋白酶消化----培養(yǎng)基終止）2000轉(zhuǎn)/分離心10min去上清液PBS重懸，重復(fù)6的步驟去上清加入100ul1mg/mlPI和100ul1mg/mlRNaseA,避光處理30min流式細(xì)胞儀檢測(cè)6、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力活細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體脫氫酶活性，可將染料MTT還原為難溶的紫色結(jié)晶物沉積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)酸性異丙醇溶解后呈現(xiàn)的色度可反映出生活細(xì)胞的代謝水平。而死細(xì)胞則無(wú)此酶活性。MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率基本步驟細(xì)胞培養(yǎng)消化細(xì)胞計(jì)數(shù)種植96孔板（1~10X103個(gè)細(xì)胞/孔）藥物處理細(xì)胞，結(jié)束4小時(shí)前每孔加入20ul5mg/mlMTT棄上清，每孔加100ulDMSO560nm檢測(cè)Viability(%)=OD560,TV/OD560,control×1007、成集落實(shí)驗(yàn)（Colong-formingtest）在集落刺激因子存在下培養(yǎng)細(xì)胞，可刺激培養(yǎng)細(xì)胞分化產(chǎn)生大小不同的細(xì)胞集落，這樣的集落形成細(xì)胞稱體外培養(yǎng)集落形成細(xì)胞，它是檢驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞能否增殖的過(guò)硬指標(biāo)之一。平均集落數(shù)集落形成率=×100%

接種的單個(gè)細(xì)胞數(shù)（二）細(xì)胞固定與染色觀察1、細(xì)胞固定2、細(xì)胞染色

H.E（蘇木精-伊紅）：樣品制備、染細(xì)胞核、染細(xì)胞質(zhì)、脫水、透明和封片。

Giemsa染色法：細(xì)胞核或染色體染成紫紅色或藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。Feulgen染色法：考馬斯亮藍(lán)染色法：細(xì)胞骨架。

免疫熒光染色免疫過(guò)氧化物酶染色法3、細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法活體染色：在體外條件下用某種染色劑對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色,而對(duì)活細(xì)胞的生理活動(dòng)不產(chǎn)生任何明顯的影響。用于活體染色的染料稱為活體染料或活體染色劑，分為堿性和酸性兩類：堿性活體染料：次甲基藍(lán)、中性紅、詹納斯綠、甲基紫等，常用于體外活體染色。酸性活體染料：臺(tái)盼藍(lán)、剛果紅等，只用于體內(nèi)活體染色，體外活細(xì)胞難以著色?；铙w染色方法1）臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染上蘭色。2）吖啶橙熒光染色法直接染色觀察活細(xì)胞或固定染色觀察細(xì)胞。吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下，原來(lái)的活細(xì)胞，其核呈亮綠色，核仁、RNA呈桔紅色，胞質(zhì)呈淡紅褐色。而原來(lái)是已經(jīng)死亡的細(xì)胞，核呈暗綠色，胞質(zhì)呈亮銅色。染色排除檢測(cè)法

以死細(xì)胞和活細(xì)胞對(duì)色素的不同吸附來(lái)鑒別。死細(xì)胞的細(xì)胞膜透性發(fā)生變化，染料大量進(jìn)入而不能排出，因此而著色。而活細(xì)胞能及時(shí)排出進(jìn)入細(xì)胞的染料或染料不能進(jìn)入活細(xì)胞，故不著色。這類染料大多為酸性染料，主要有：臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、赤蘚紅B、伊紅Y等。1、臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法2、溴化乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法

EB和PI均為熒光染料，可特異與DNA結(jié)合。發(fā)橙紅色熒光的為死細(xì)胞。（四）凋亡細(xì)胞的觀察細(xì)胞凋亡是一種不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡方式，是在一定的生理或病理情況下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過(guò)基因調(diào)控，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而發(fā)生的細(xì)胞自動(dòng)消亡的過(guò)程，亦稱為程序化細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)形態(tài)學(xué)檢測(cè)光學(xué)顯微鏡觀察樣品涂片或組織切片經(jīng)常規(guī)處理、HE染色后，即可放在油鏡下觀察。該方法簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是只有在發(fā)現(xiàn)了具有特征性的凋亡小體時(shí)才能確定為陽(yáng)性，因而不易檢出早期的凋亡細(xì)胞，而且某些類型的細(xì)胞壞死(如凝固性壞死)與細(xì)胞凋亡形態(tài)相似，兩者不易區(qū)分。因此，該方法只能作為細(xì)胞凋亡初步推測(cè)的基礎(chǔ)，不能作為診斷的手段。熒光顯微鏡觀察根據(jù)細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞對(duì)陽(yáng)離子染料有拒染能力，而壞死細(xì)胞可被上述染料標(biāo)記的原理，用熒光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙錠(EB)等染色，在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核改變和凋亡小體的形成。這種方法適用于對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞懸液的檢測(cè)．組織脫蠟切片經(jīng)RNA酶作用后也可用此法染色觀察。熒光顯微鏡檢查法方便易行，現(xiàn)已成為細(xì)胞凋亡檢查的常用手段。透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞在電子顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體增多，細(xì)胞膜微絨毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小體。超微結(jié)構(gòu)觀察是診斷細(xì)胞凋亡最可靠的方法。但該法只能定性，不能定量，而且觀察到凋亡小體的幾率也不高，在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，凋亡小體可能很快被巨噬細(xì)胞吞噬清除，而不易觀察到；此外，用電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡，樣品制備步驟繁瑣、耗時(shí)、昂貴。共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型儀器，是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使紫外光和可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而得到清晰的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。該方法能用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析，而且還能對(duì)凋亡細(xì)胞內(nèi)的大分子進(jìn)行定位。上述形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法最大的局限性是只能定性，不能有效定量，而且判定時(shí)難免存在主觀性，故常作為其他檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。凋亡細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的分析與檢測(cè)染料排斥法除了電子顯微鏡能反映細(xì)胞膜的完整性外，還可用染料排斥法，如臺(tái)盼藍(lán)、PI等。壞死細(xì)胞的膜發(fā)生破損，易被染料著染，而凋亡細(xì)胞的膜完整，不被著染，從而可以判斷細(xì)胞凋亡與壞死。但在體外培養(yǎng)的細(xì)胞最終也會(huì)發(fā)生繼發(fā)性壞死，因此，此法不能單獨(dú)用來(lái)判斷Ap細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞儀觀察法流式細(xì)胞儀觀察是判斷細(xì)胞質(zhì)膜的不對(duì)稱性。在正常細(xì)胞膜上，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)；而在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。因此，PS基團(tuán)位置的改變，可作為凋亡細(xì)胞的一種標(biāo)志。膜聯(lián)蛋白中的Annexin—V，即錨定蛋白，是一種Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高親和力。將Annexin—V進(jìn)行熒光素(FITC、PE)標(biāo)記，以標(biāo)記的Annexin—V處理細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞儀(或熒光顯微鏡)即可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。若將Annexin—V和熒光素PI匹配使用，可以將凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)：Annexin—V為陽(yáng)性，PI為陰性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞；雙染色細(xì)胞或是壞死細(xì)胞，或是凋亡晚期細(xì)胞(歸因于次級(jí)壞死)。DNA片段化檢測(cè)

DNA電泳圖譜法細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180～200bp長(zhǎng)的DNA片段或整數(shù)倍的寡核苷酸片段。凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜，而壞死細(xì)胞電泳后呈模糊的涂片狀。ELlSA法分析組蛋白細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Ca、Mg依賴性內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體連接區(qū)切開(kāi)雙鏈DNA，產(chǎn)生帶有單個(gè)或寡聚核小體的DNA片段。而核小體DNA與中心組蛋白HzA、H。B、Hs和H緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的DNA片段是180～200bp的整數(shù)倍，在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體?]。該法是利用“夾心定量酶標(biāo)免疫測(cè)定法”的原理，用抗組蛋白一生物素和抗DNA一過(guò)氧化物酶(POD)分別結(jié)合到核小體的組蛋白和DNA成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗體后，加入POD底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)測(cè)定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡的水平。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高，操作快捷，無(wú)放射性同位素污染，可定量測(cè)定細(xì)胞凋亡，無(wú)需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性，POD標(biāo)記的抗DNA抗體可與單鏈和雙鏈的DNA起反應(yīng)?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測(cè)定核小體單體和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè)]。DNA末端標(biāo)記法1993年Wijsman等提出了DNA片段末端標(biāo)記法，1994年Fehsel等。提出了原位缺口轉(zhuǎn)移檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。這些方法的建立特別是由DNA片段末端標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltrans—ferase(TdT)一mediateddUTP—biotinnickendlabel—ling，TUNELlabeling的試劑盒化，使細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)在諸多領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用。舉例

形態(tài)學(xué)檢測(cè)基本步驟細(xì)胞培養(yǎng)消化細(xì)胞計(jì)數(shù)種植24孔板（1~5X104個(gè)細(xì)胞/孔）藥物處理細(xì)胞用數(shù)碼照相架拍攝形態(tài)照片吸走培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，95%乙醇固定20min吸走乙醇每孔加200ul丫啶橙避光10min激