酶促反應動力學

第二章酶促反應動力學現(xiàn)在是1頁\一共有106頁\編輯于星期日

第一節(jié)

酶催化反應的基本特征

酶是生物提高其生化反應效率而產(chǎn)生的生物催化劑，其化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)。在生物體內(nèi)，所有的反應均在酶的催化作用下完成，幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密聯(lián)系。生物酶分為六大類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構酶、合成酶。

現(xiàn)在是2頁\一共有106頁\編輯于星期日酶催化反應和化學催化反應的轉(zhuǎn)換數(shù)大小的比較

催化劑反應轉(zhuǎn)換數(shù)mol/（中心點·S）溫度℃酶催化劑菠蘿蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶碳酸肝酶

肽的水解肽的水解肽的水解羰基化合物的可逆反應

4×10-3~5×10-18×10-2~1×103×10-3~1×1028×10-1~6×105

0~370~370~370~37化學催化劑硅膠－氧化鋁硅膠－氧化鋁二氧化釩二氧化釩異丙基苯裂解異丙基苯裂解環(huán)己烷脫氫環(huán)己烷脫氫

3×10-82×1047×10-111×102

2542025350現(xiàn)在是3頁\一共有106頁\編輯于星期日酶活力表示方法酶的分子活力：在最適宜條件下，每1mol酶在單位時間內(nèi)所能催化底物的最大量（mol）酶的催化中心活力：在單位時間內(nèi)，每一個酶的催化中心所催化底物的量（mol）酶活力：在特定條件下，每1min能催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物時所需要的酶量，稱為一個酶單位，或稱為國際單位，用U表示。酶活力還可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶單位數(shù)，用U/mg表示?，F(xiàn)在是4頁\一共有106頁\編輯于星期日絕對專一性：一種酶只能催化一種化合物進行一種反應

相對專一性：一種酶能夠催化一類具有相同化學鍵或基團的物質(zhì)進行某種類型的反應

反應專一性：一種酶只能催化某化合物在熱力學上可能進行的許多反應中的一種反應

底物專一性：一種酶只能催化一種底物

立體專一性：一種酶只能作用于所有立體異構體中的一種

現(xiàn)在是5頁\一共有106頁\編輯于星期日第二節(jié)均相的酶促反應動力學現(xiàn)在是6頁\一共有106頁\編輯于星期日1.1.酶促反應的Michaelis-Menten方程1.1.1.酶促反應的Michaelis-Menten方程

Michaelis、Menten（1913）提出了單一底物的酶反應模型，基本內(nèi)容是：酶E的底物S首先形成酶—底物復合物ES，在酶—底物復合物ES的基礎上反應生成產(chǎn)物P和酶E。反應式如下：E+SES

E+Pk+1k+2k1現(xiàn)在是7頁\一共有106頁\編輯于星期日其中：k+1，k1，k+2——反應速度常數(shù)

E，S，ES，P——酶，底物，酶-底物復合物，產(chǎn)物根據(jù)Michaelis、Menten的單一底物的酶反應模型，其假設條件為：（1）在反應過程中，限制反應速度的反應是ES到E+P這一步反應；（2）E+S到ES的反應在整個過程中始終處于動態(tài)平衡；（3）酶以酶游離狀態(tài)E和酶-底物復合物ES的形式存在，酶在反應過程中總濃度不變；（4）底物濃度比酶-底物絡合物濃度要大得多。現(xiàn)在是8頁\一共有106頁\編輯于星期日根據(jù)反應的假設條件，可以看出Michaelis、Menten所建立的酶促反應模型式建立在平衡的基礎之上的，因而稱之為“平衡態(tài)理論”?，F(xiàn)在是9頁\一共有106頁\編輯于星期日根據(jù)假設（1），有單一底物的酶催化反應的反應速度：（1-1）式中：CP，CS——產(chǎn)物，底物的濃度

t——時間根據(jù)假設（2）有（1-2）現(xiàn)在是10頁\一共有106頁\編輯于星期日即：（1-3）

式中：——酶—底物復合物的解離常數(shù)現(xiàn)在是11頁\一共有106頁\編輯于星期日根據(jù)假設（3），有：總酶量：（1-4）聯(lián)立（1-1）、（1-2）、（1-3）、有（1-5）式中：Vmax——最大的酶促反應速度。

（1-6）現(xiàn)在是12頁\一共有106頁\編輯于星期日1.1.2Briggs-Haldane對M-M方程的修正

1925年Briggs和Haldane認為在酶促反應過程中，反應的中間體ES（酶-底物復合物）的濃度不隨反應時間而變化，即在酶促反應過程中，反應的中間體ES的濃度處于穩(wěn)定的狀態(tài)，基于這一假設所得到的酶促反應的模型稱之為“穩(wěn)定態(tài)理論”。即（1-7）

現(xiàn)在是13頁\一共有106頁\編輯于星期日則

（1-8）其中（1-9）稱作M-M常數(shù)現(xiàn)在是14頁\一共有106頁\編輯于星期日代入總酶量（1-4）得（1-10）將（1-10）式代入（1-1）式，有（1-11）現(xiàn)在是15頁\一共有106頁\編輯于星期日1.1.3Michaelis-Menten方程的參數(shù)估計對特定的酶促反應，其動力學的M-M方程中的Vmax和Km是該酶促反應的特征參數(shù)。對Vmax和Km的確定的方法有Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；積分法等（1）Lineweaver-Burk法（簡稱L-B法）對M-M方程（1-11）式取倒數(shù)，得到（1-12）

現(xiàn)在是16頁\一共有106頁\編輯于星期日

（2）Hanes-Woolf法（簡稱H-W法）對L-B法的（1-12）式的等式兩端同乘CS，此種方法減少了CS值過大或過小所帶來的測量誤差。（1-13）

（3）Eadie-Hofstee法（簡稱E-H法）將M-M方程重排得到：（1-14）現(xiàn)在是17頁\一共有106頁\編輯于星期日（4）積分法用不同的酶促反應的時間t與其反應過程相對應的底物濃度之間的函數(shù)關系通過作圖或回歸的方法確定酶促反應動力學參數(shù)。（1-15）現(xiàn)在是18頁\一共有106頁\編輯于星期日例：在pH5.1、15℃下所測定的用葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的反應初速度V0如表所示。求這一酶促反應的動力學參數(shù)Vmax和Km

。表1-1葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的反應初速度與底物濃度CS（mmol/L）V0（mmol/L·min）5.550.1638.330.21111.110.24113.890.27616.660.30122.220.33927.770.347現(xiàn)在是19頁\一共有106頁\編輯于星期日

解：采用Lineweaver-Burk法，對實驗數(shù)據(jù)回歸，有則

現(xiàn)在是20頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是21頁\一共有106頁\編輯于星期日采用Hanes-Woolf法，對實驗數(shù)據(jù)回歸，有

則

現(xiàn)在是22頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是23頁\一共有106頁\編輯于星期日采用Eadie-Hofstee法，對實驗數(shù)據(jù)回歸，有則

現(xiàn)在是24頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是25頁\一共有106頁\編輯于星期日1.1.4酶促反應的反應級數(shù)（1）當CS遠小于Km時，為一級反應（2）當CS遠大于Km時，為零級反應?，F(xiàn)在是26頁\一共有106頁\編輯于星期日（3）當CS介于上述兩者之間時，為0至1級反應現(xiàn)在是27頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2有抑制作用的酶促反應動力學1.2.1競爭性抑制的酶促反應動力學當反應物系中存在與底物的結構相似的物質(zhì)，這一物質(zhì)也可能與酶的活性部位結合，形成非活性的復合物，阻礙了酶與底物的結合，從而影響酶促反應，這種抑制作用稱為競爭性抑制。現(xiàn)在是28頁\一共有106頁\編輯于星期日競爭性抑制的機理為：其中：k+3，k+3—反應速度常數(shù)I，EI—抑制劑，酶-抑制劑復合物E+SES

E+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3現(xiàn)在是29頁\一共有106頁\編輯于星期日基于穩(wěn)定態(tài)理論，有（1-16）（1-17）總酶量為（1-18）現(xiàn)在是30頁\一共有106頁\編輯于星期日聯(lián)立（1-4）、（1-16）、（1-17）、（1-18）式，有（1-19）式中：KmI—競爭性抑制的表觀M-M常數(shù)KI—抑制劑的解離常數(shù)

（1-20）

現(xiàn)在是31頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是32頁\一共有106頁\編輯于星期日對有競爭性抑制的酶促反應動力學方程（1-19）式取倒數(shù)得到（1-21）現(xiàn)在是33頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是34頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2.2非競爭性抑制的酶促反應動力學當反應物系中存在與酶的活性部位以外相結合，且這一結合與底物的結合無競爭性關系的抑制作用稱為非競爭性抑制。與競爭性抑制相比較，當有非競爭性抑制劑時，無論如何提高底物的濃度也不會消除其抑制作用。

現(xiàn)在是35頁\一共有106頁\編輯于星期日非競爭性抑制的作用機理為：E+SES

E+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3EI+SSEIk+4k4ES+ISEIk+5k5現(xiàn)在是36頁\一共有106頁\編輯于星期日其中：k+4，k-4，k+5，k-5，—反應速度常數(shù)I，EI—抑制劑，酶-抑制劑復合物IES—底物、酶-抑制劑三元復合物基于穩(wěn)定態(tài)理論，有（1-22）總酶量為

（1-23）現(xiàn)在是37頁\一共有106頁\編輯于星期日有非競爭性抑制的酶促反應動力學方程（1-24）現(xiàn)在是38頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是39頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是40頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2.3反競爭性抑制動力學反競爭性抑制的特點是抑制劑不能直接與游離酶相結合，而只能與復合物[Es]相結合生成[SEI]復合物?，F(xiàn)在是41頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是42頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是43頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是44頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是45頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是46頁\一共有106頁\編輯于星期日抑制百分數(shù)i:

表示抑制劑對酶催化反應的抑制程度。

i值愈大，表示抑制的程度愈大；i值愈小，抑制程度愈小。0≤i≤1?，F(xiàn)在是47頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是48頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2.4高濃度底物抑制作用的酶促反應動力學應用穩(wěn)態(tài)理論，可得到底物抑制的酶促反應動力學方程為（1-25）E+SES

E+Pk+1k+2k1ES+SSESk+3k3現(xiàn)在是49頁\一共有106頁\編輯于星期日根據(jù)即現(xiàn)在是50頁\一共有106頁\編輯于星期日解得：最佳底物濃度：現(xiàn)在是51頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是52頁\一共有106頁\編輯于星期日例：在含有相同酶濃度的五個反應物系中，分別加入不同濃度的底物，并測定其初始速率，然后再在同樣五個反應物系中分別加入濃度為2.2×10-1mmol／L的抑制劑，并測其初始的反應速率，其數(shù)據(jù)見下表?，F(xiàn)在是53頁\一共有106頁\編輯于星期日解以L—B作圖法來判斷抑制類型并求其參數(shù)。據(jù)此上述實驗數(shù)據(jù)分別取其例數(shù)，以l／rSI對1／Cs做圖，得到如圖所示兩條直線，它們在縱軸有一共點交點，這表明該抑制為競爭性抑制?，F(xiàn)在是54頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是55頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是56頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2.5復雜的酶催化反應動力學一、可逆酶反應動力學Kmp和Km分別為正、逆反應米氏常數(shù)；rP,maxrs,max分別為正逆反應的最大速率現(xiàn)在是57頁\一共有106頁\編輯于星期日反應的凈速率式

若令：

式中Ke一一反應平衡常數(shù)

現(xiàn)在是58頁\一共有106頁\編輯于星期日二、產(chǎn)物抑制的酶反應動力學產(chǎn)物抑制系指當產(chǎn)物與酶形成復合物EP后，就停止繼續(xù)進行反應的情況，特別是當產(chǎn)物濃度較高時有可能出現(xiàn)這種抑制。其反應機理所生成EP為無活性的端點復合物應用穩(wěn)態(tài)法推導得出如下反應速率方程式現(xiàn)在是59頁\一共有106頁\編輯于星期日三、多底物酶反應動力學（1）隨機機制兩個底物S1和S2隨機地與酶結合，產(chǎn)物P1和P2也隨機地釋放出來。

其機理可表示為

現(xiàn)在是60頁\一共有106頁\編輯于星期日式中:Cs1和Cs2分別為底物sl與s2的濃度，K1、K3、K4分別為相應各步的解離常數(shù)

現(xiàn)在是61頁\一共有106頁\編輯于星期日（2）順序機制兩個底物Sl和s2與酶結合成復合物是有順序的，酶先與底物s1結合形成〔Es1〕復合物，然后該復合物Esl再與s2結合形成具有催化活性的[ES1S2]。按同樣推導方法求出下述方程式：式中:Cs1和Cs2分別為底物sl與s2的濃度，K1、K3、K4分別為相應各步的解離常數(shù)。

現(xiàn)在是62頁\一共有106頁\編輯于星期日（3）乒乓機制

與始終不同時與酶結合，其機理可表示為（為修改過的酶）：導得：(2.38)現(xiàn)在是63頁\一共有106頁\編輯于星期日

四、變構酶催化反應動力學如磷酸果糖激酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，蘇氨酸脫氫酶和己糖激酶等的催化反應，底物分子與這類酶結合時能誘導酶的結構改變增加E與S的結合能力，表現(xiàn)出底物對酶的激活效應。其機理復雜提出的模型較多，一般用Hill經(jīng)驗公式：(2.39)式中：n—Hill指數(shù)表示每個酶分子與底物結合部位的數(shù)目，n=1~3.2參數(shù)求?。?2.40)現(xiàn)在是64頁\一共有106頁\編輯于星期日與式(2.39),(2.40)相應的曲線見圖2.15,圖2.16。（還有常用的表達式：等）圖2.15Hill經(jīng)驗方程圖2.16變構酶動力學參數(shù)現(xiàn)在是65頁\一共有106頁\編輯于星期日1.2.6.影響酶催化反應的因素內(nèi)部因素——酶的結構特征，底物的結構特征。外部因素——pH,t,p,離子強度，……（1）pH值的影響酶分子上AA側(cè)鏈基團一定的解離狀態(tài)及其解離度（催化活性）一般酶活性與pH呈鐘型曲線為圖2.9現(xiàn)在是66頁\一共有106頁\編輯于星期日4812圖2.9某酶的穩(wěn)定性與活性PH-rs相對值現(xiàn)在是67頁\一共有106頁\編輯于星期日（2）溫度的影響T<Topt則其對酶促反應的速度常數(shù)K+2的影響符合Arr.eq:K+2=A.exp(-Ea/RT)(2.41)現(xiàn)在是68頁\一共有106頁\編輯于星期日第三節(jié)

固定化酶催化反應動力學現(xiàn)在是69頁\一共有106頁\編輯于星期日3.1固定化酶的性質(zhì)不同于原游離酶性質(zhì)的原因是：①在酶的固定化過程中產(chǎn)生的；②實際使用中由于傳遞阻力等的變化引起的。要預測固定化酶反應進行中的實際狀態(tài)，就必須了解固定化酶反應動力學特征及其相關參數(shù)與反應速率關系?，F(xiàn)在是70頁\一共有106頁\編輯于星期日以微膠囊包埋法固定化酶促反應(圖2—5)為例，其反應歷程由如下5步組成：①底物由主體溶液傳遞到固定化酶載體的外表面；②底物由外表面向載體內(nèi)擴散；③進行酶促反應；④產(chǎn)物由內(nèi)部擴散到載體外表面；⑤產(chǎn)物傳遞到主體溶液。當酶固定化于載體的外表面時，沒有②和④兩個階段。可以看出，固定化酶的催化反應受到了物質(zhì)傳遞和酶促反應兩個方面的影響。現(xiàn)在是71頁\一共有106頁\編輯于星期日3.2影響固定化酶促反應的主要因素(1)分子構象的改變酶分子構象的改變(圖2—6)是指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構象發(fā)生了變化，導致酶與底物的結合活力下降的一種效應。這種效應多出現(xiàn)于吸附法和共價偶聯(lián)法的固定化酶中，難以定量描述與預測?，F(xiàn)在是72頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是73頁\一共有106頁\編輯于星期日(2)位阻效應位阻效應(圖2—6)是載體的遮蔽作用(如載體的空隙太小，或者固定化位置或方法不當，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成空間障礙，使底物和效應物無法與酶接觸等)引起的。選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應難以定量描述?，F(xiàn)在是74頁\一共有106頁\編輯于星期日(3)微擾效應由于載體的親水性、疏水性及介質(zhì)的介電常數(shù)等，使緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域(微環(huán)境，圖2—7)發(fā)生變化，改變了酶的催化能力及酶對效應物做出調(diào)節(jié)反應的能力。這種效應難以定量描述和預見，但可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)而做出判斷與調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在是75頁\一共有106頁\編輯于星期日(4)分配效應分配效應是由于固定化載體與底物或效應物之間的疏水性、親水性及靜電作用所引起微環(huán)境(固定化酶緊鄰的微觀局部環(huán)境)和宏觀環(huán)境之間物質(zhì)的不等分配，改變了酶反應系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應速率的一種效應。現(xiàn)在是76頁\一共有106頁\編輯于星期日(4)分配效應分配效應可以通過分配系數(shù)KP，來定量描述，KP的定義是載體內(nèi)外底物(或其他物質(zhì))濃度之比。底物的KP可通過如下方法測定：在已知濃度和體積的底物溶液中，放人不含底物的一定體積的載體，并保持適宜條件，當達到平衡時，測定載體外溶液中的底物濃度。現(xiàn)在是77頁\一共有106頁\編輯于星期日(5)擴散限制擴散限制是指底物、產(chǎn)物及其他效應物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。一般水溶液及凝膠中的物質(zhì)擴散系數(shù)很低，當酶的催化活性很高時，在固定化酶的周圍形成濃度梯度，造成微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間底物和產(chǎn)物的濃度有差別。現(xiàn)在是78頁\一共有106頁\編輯于星期日(5)擴散限制擴散限制的大小可通過引入相應的參數(shù)進行定量分析。作為一般規(guī)律，如果酶的催化反應速率很小，擴散限制的影響小或沒有，此時的酶促反應階段成為整個反應的限速階段?，F(xiàn)在是79頁\一共有106頁\編輯于星期日3.3固定化酶反應動力學固定化酶催化反應中的反應速率是通過測定宏觀環(huán)境中底物和產(chǎn)物的濃度而獲得的，它代表所有局部速率總和的平均值。反應總速率與宏觀環(huán)境中相關濃度的關系，不同于其與微環(huán)境中相關濃度的關系。反應總速率為多種因素所影響，如果不能準確把握反應總速率與底物或產(chǎn)物在固定化酶顆粒內(nèi)外的傳遞特性，就不可能得到正確的反應動力學方程?，F(xiàn)在是80頁\一共有106頁\編輯于星期日3.4固定化酶促反應中的過程分析固定化酶促反應過程中，需考慮擴散傳質(zhì)與催化反應的相互影響，注意外部與內(nèi)部擴散的不同傳質(zhì)方式。內(nèi)部擴散與催化反應有時是同時進行的，兩者相互影響。外擴散通常先于反應。在分析固定化酶的反應與外部或內(nèi)部物質(zhì)傳遞之間的相互關系時，采用的數(shù)學方法不同。為簡化起見，在討論外部擴散時，忽略固定化酶顆粒內(nèi)部的擴散問題；討論內(nèi)部擴散時，假定固定化酶顆粒外部傳質(zhì)阻力小，顆粒外表面處的底物濃度與主體溶液中底物濃度相等?，F(xiàn)在是81頁\一共有106頁\編輯于星期日3.4.1.外部擴散過程底物由液體主體向固定化酶顆粒表面的擴散速率N，正比于傳質(zhì)表面積及傳質(zhì)推動力，即現(xiàn)在是82頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是83頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是84頁\一共有106頁\編輯于星期日現(xiàn)在是85頁\一共有106頁\編輯于星期日3.4.2.內(nèi)部擴散過程對具有大量內(nèi)孔的球形固定化酶顆粒，其內(nèi)部是酶促反應的主要場所。底物通過孔口向內(nèi)擴散，達到不同深度，產(chǎn)物沿反方向從內(nèi)部向孔口外擴散。顆粒內(nèi)部各處底物和產(chǎn)物的濃度不同，導致各處的反應速率和選擇性的差異。這就是說，在同現(xiàn)在是86頁\一共有106頁\編輯于星期日3.4.2.內(nèi)部擴散過程在同樣的主體濃度下，內(nèi)部各處是不等效的，這就提出了內(nèi)部傳遞效率的問題。與外部傳遞不同，內(nèi)部傳遞和反應多數(shù)不是串聯(lián)的過程，而是平行的過程，即底物一邊向內(nèi)擴散，一邊進行反應。對內(nèi)部擴散過程的效率因子ηin