培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座

一、消毒與滅菌區(qū)分：所謂滅菌就是殺死一切微生物，包含微生物營(yíng)養(yǎng)體和芽孢。消毒是指毀滅一切致病微生物（病原體）。

二、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用牛奶巴氏消毒法：80-95℃，10min發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌:121℃,20min培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第1頁(yè)三、滅菌方法：1、干熱滅菌：灼燒滅菌；加熱方式有電熱、紅外線加熱等；相對(duì)與濕熱滅菌，干熱要求時(shí)間長(zhǎng)，溫度高（普通160℃，2hr）1）火焰焚燒法：接種環(huán)、試管口等2）干烤法：利用熱空氣滅菌使用方法：160℃,2小時(shí)特點(diǎn)：因?yàn)榭諝鈧鳠岽┩噶Σ?，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死。所以溫度高、時(shí)間長(zhǎng)。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第2頁(yè)2、濕熱滅菌：蒸氣釋放熱量，使微生物蛋白質(zhì)變性。特點(diǎn)：溫度低、時(shí)間短、滅菌效果好原因：1)菌體內(nèi)含水量越高，則凝固溫度越低；2)蒸汽冷凝會(huì)放出潛熱；3)飽和水蒸汽穿透力強(qiáng)；4)濕熱易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子穩(wěn)定

性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第3頁(yè)濕熱滅菌優(yōu)點(diǎn)：1）蒸氣起源易，低價(jià)無(wú)毒；2）蒸氣穿透力強(qiáng)滅菌徹底；3）蒸氣冷凝釋放熱量；4）蒸氣易輸送，易調(diào)整，易管理。濕熱滅菌缺點(diǎn)：1）設(shè)備費(fèi)用高；2）不能用于怕受潮物料；培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第4頁(yè)3、射線滅菌法：

1）電離輻射：χ、γ、β射線。

原理：引發(fā)水和其它物質(zhì)電離，產(chǎn)生游離基，破壞DNA，從而造成細(xì)胞損傷。特點(diǎn)；穿透力強(qiáng)，無(wú)專一性，對(duì)全部生物都有殺傷作用。適用：菌種誘變。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第5頁(yè)2）非電離輻射（紫外線）方法：在波長(zhǎng)265-266nm處，殺菌力最強(qiáng)。原理：（1）作用于DNA，使同鏈DNA相鄰嘧啶間形成嘧啶二聚體，引發(fā)DNA結(jié)構(gòu)變形，妨礙正常堿基配對(duì)，從而造成菌變異或死亡。（光復(fù)活酶可修復(fù)）（2）有氧時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，強(qiáng)氧化殺菌。適用：空氣、水消毒殺菌（紫外燈）。特點(diǎn)：穿透力差。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第6頁(yè)3.過(guò)濾滅菌法采取介質(zhì)過(guò)濾方法阻截微生物到達(dá)除菌目標(biāo)主要用于空氣滅菌培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第7頁(yè)4、化學(xué)藥品滅菌方法：浸泡、熏蒸、噴灑、擦拭等，慣用化學(xué)藥品：1）表面消毒劑：（1）酚類：

石炭酸（苯酚），0.1%抑菌；1%殺菌甲酚皂（甲酚+肥皂）：3-5%皮膚消毒機(jī)理：作為表面活性劑，使膜損傷；蛋白質(zhì)變性P.C.（石炭酸系數(shù)）：為消毒劑殺菌效率標(biāo)準(zhǔn)。是在一定時(shí)間內(nèi)（10min）被測(cè)試藥劑能殺死全部供試微生物最高稀釋度與到達(dá)一樣效果酚最高稀釋度比值。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第8頁(yè)（2）醇類：乙醇：70-75%殺菌效率最高機(jī)理：具脫水作用，能穿透菌體進(jìn)入蛋白質(zhì)分子肽鏈間隙，使蛋白質(zhì)變性或脫水沉淀，造成微生物死亡。無(wú)水乙醇：表面蛋白凝固，保護(hù)膜，殺菌力差甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒劑；其它醇因不溶于水，普通不用。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第9頁(yè)（3）醛類：甲醛：

機(jī)理：蛋白質(zhì)烷化劑；

應(yīng)用：福爾馬林（40%）；

10%甲醛熏蒸，用于空氣滅菌。（4）表面活性劑：可降低表面張力效應(yīng)物質(zhì)。機(jī)理：使菌體細(xì)胞膜破損；使菌體蛋白質(zhì)變性。種類：洗必泰、新潔爾滅等特點(diǎn)：快速、徹底、效率高培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第10頁(yè)（5）氧化劑類：機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)巰基，強(qiáng)氧化劑可破壞蛋白質(zhì)氨基與酚羥基碘酒7gI：5gKI，溶于100ml95%乙醇。1%碘酒10min可殺死芽孢桿菌和部分真菌，并使流感病毒滅活。漂白粉（氯化鈣與次氯酸鈣混合物）培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第11頁(yè)（6）重金屬及其化合物：全部重金屬鹽Cu、As、Ag、Hg等對(duì)微生物都有毒性。機(jī)理：1）可與酶蛋白-SH基結(jié)合，使酶失活；2）易與帶陰電荷菌體蛋白吸附，使之變性沉淀。應(yīng)用：波爾多液、紅汞、硝酸銀等。特點(diǎn)：簡(jiǎn)便。但使用應(yīng)慎重，預(yù)防在體內(nèi)積累。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第12頁(yè)（7）pH殺菌作用酸:蛋白質(zhì)變性無(wú)機(jī)酸:殺菌力與H+濃度成正比。有機(jī)酸:與不電離部分成正比,故有時(shí)有機(jī)酸滅菌效果>無(wú)機(jī)酸，分子殺菌力大于離子。堿:強(qiáng)堿造成蛋白質(zhì)、核酸大分子變

性、水解，使菌死亡。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第13頁(yè)2）抗代謝藥品機(jī)理：與正常代謝產(chǎn)物同時(shí)存在，并產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用（與對(duì)應(yīng)酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合）。只有當(dāng)正常代謝產(chǎn)物量少或不存在時(shí)，抗代謝物才有用。種類：磺胺——抑制葉酸合成6-巰基嘌呤——抑制嘌呤合成5-甲基色氨酸——抑制氨基酸合成機(jī)理：磺胺——對(duì)氨基苯甲酸類似物，競(jìng)爭(zhēng)性地與二氫葉酸合成酶結(jié)合，抑制葉酸合成培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第14頁(yè)3）

抗生素（1）抗生素：生物產(chǎn)生一個(gè)次生代謝產(chǎn)物或其衍生物，在低濃度下抑制或影響其它生物生命活動(dòng)。（2）抗菌譜：抗生素作用對(duì)象有一定范圍，將這一范圍稱該抗生素抗菌譜。廣譜：對(duì)各種微生物有作用（四環(huán)素G+，G-）窄譜：僅對(duì)某一類微生物有作用（青霉素G+）（3）效價(jià)：抑菌圈大小，生物活性單位，標(biāo)準(zhǔn)曲線培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第15頁(yè)抗生素作用機(jī)理：1）對(duì)細(xì)胞壁形成有抑制作用；（如：青霉素）2）影響細(xì)胞膜功效；（如：多粘菌素）3）抑制蛋白質(zhì)合成；（如：綠霉素、鏈霉素）4）干擾核酸代謝；（如：利福霉素、灰黃霉素）抗藥性：變異、適應(yīng)、進(jìn)化原因：藥品無(wú)效；藥品被修飾；R質(zhì)粒（藥品抗性基因）培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第16頁(yè)二、濕熱滅菌原理1.微生物熱阻：微生物對(duì)熱抵抗力；

定義：微生物熱阻就是指微生物對(duì)熱抵抗能力。其對(duì)熱抵抗能力越大，能夠了解為熱阻越大，衡量不一樣微生物對(duì)熱抵抗能力大小，能夠使用相對(duì)熱阻概念。相對(duì)熱阻：兩種微生物熱阻之比。比如：芽孢/大腸桿菌=3000000/1；（表3-1）病毒/大腸桿菌=1—5/1致死溫度：殺死微生物極限溫度；致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物時(shí)間；溫度越高，致死時(shí)間越短。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第17頁(yè)2.微生物熱致死動(dòng)力學(xué)：對(duì)數(shù)殘留定律。菌體是一個(gè)復(fù)雜高分子體系，其受熱被殺死，主要原因是高溫能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)（一級(jí)反應(yīng)），所以，雜菌在一定溫度下受熱死亡過(guò)程可用單分子反應(yīng)歷程加以描述。

-dN/dt=k*N式中dN/dt：表示滅菌過(guò)程中某瞬間活菌降低速率N：表示表示滅菌過(guò)程中某瞬間活菌數(shù)K：表示滅菌過(guò)程中菌體死亡速度常數(shù)培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第18頁(yè)上式積分形式為：t=（2.303/k）×lnN0/Nt

式中——N0，Nt：分別表示滅菌前、滅菌后培養(yǎng)基中菌體濃度（個(gè)/ml）滅菌時(shí)間t取決于污染程度N0、滅菌程度Nt與滅菌速度常數(shù)K滅菌程度：對(duì)于Nt，假如取Nt=0，那么，t=∞，這顯然是與現(xiàn)實(shí)情況不符。對(duì)于怎樣Nt取值？通常取Nt=10-3，即滅菌1000次，有一次是失敗，殘留了一個(gè)活菌體。這個(gè)數(shù)值取值大小，也間接反應(yīng)了該生產(chǎn)過(guò)程中技術(shù)管理水平。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第19頁(yè)3.熱致死反應(yīng)速度常數(shù)KK是表示微生物耐熱性特征常數(shù)，K除了決定于菌體種類及存在形式外，還是溫度函數(shù)（與普通化學(xué)反應(yīng)一樣），所以滅菌溫度選擇是滅菌操作關(guān)鍵。K越小，該微生物越耐熱，121℃細(xì)菌芽孢K為1min-1,而營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為10-1010min-14、殺滅芽孢溫度和時(shí)間不一樣芽孢耐熱性不一樣,培養(yǎng)條件不一樣,耐熱性也不一樣。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第20頁(yè)5.滅菌溫度選擇溫度對(duì)化學(xué)反應(yīng)影響尤其顯著，主要是影響速度常數(shù)。滅菌溫度選擇應(yīng)考慮原因主要有：1）微生物熱致死溫度，應(yīng)高于該溫度，通常以芽孢為準(zhǔn)。2）高溫對(duì)營(yíng)養(yǎng)成份破壞，滅菌過(guò)程實(shí)質(zhì)上也是營(yíng)養(yǎng)成份破環(huán)過(guò)程，所以，滅菌溫度選擇，應(yīng)是在確保滅菌效果前提下，盡可能降低培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成份破壞。

培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第21頁(yè)速度常數(shù)與溫度之間關(guān)系（阿累尼烏斯公式）：

K=A×e[-E/RT]

式中—K：速度常數(shù)，1/SE,：活化能（J/mol）R：氣體常數(shù)，1.987*4.18J/mol*kT：反應(yīng)絕對(duì)溫度，k上式也可表示為：lgK=-E/2.303RT+lgA對(duì)于某種特定細(xì)菌，活化能E也是一定，所以，滅菌速度常數(shù)對(duì)數(shù)lgK與滅菌溫度T成反比。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第22頁(yè)三、影響培養(yǎng)基滅菌其它原因溫度:致死溫度，蛋白質(zhì)變性滅菌時(shí)間：滅菌需維持一段時(shí)間才能到達(dá)效果培養(yǎng)基成份：保護(hù)作用；pH值：pH值6-8，微生物最耐熱，表3-4；培養(yǎng)基中顆粒：顆粒大，滅菌難；泡沫：不利于滅菌。水分含量：水少-溫高時(shí)長(zhǎng)微生物數(shù)量影響：數(shù)量多，滅菌時(shí)間長(zhǎng)培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第23頁(yè)第二節(jié)滅菌計(jì)算與操作分批滅菌：分批滅菌操作關(guān)鍵點(diǎn)(1)定時(shí)檢驗(yàn)設(shè)備、管道有沒(méi)有滲漏，主要是：冷卻管道，夾套。(2)培養(yǎng)基升溫時(shí)，打開全部排氣閥門，排掉空氣。(3)培養(yǎng)基升溫時(shí)開動(dòng)攪拌系統(tǒng)，以使培養(yǎng)基內(nèi)部傳熱均勻，當(dāng)溫度升溫到100℃時(shí)，停頓攪拌，首先是為了保護(hù)軸承，另首先，當(dāng)培養(yǎng)基溫度升溫到100℃時(shí)，培養(yǎng)基沸騰，能夠起到攪拌作用。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第24頁(yè)(4)注意輔助設(shè)備滅菌：空氣過(guò)濾器、計(jì)量罐、流加管道與流加液貯罐，空氣流量計(jì)等。保溫期間溫度：118—121℃，時(shí)間：30分鐘。(5)滅菌結(jié)束后，需要馬上引入無(wú)菌空氣，確保罐內(nèi)壓力后方可冷卻，目標(biāo)是預(yù)防培養(yǎng)基冷卻使罐內(nèi)形成負(fù)壓，易染菌。分批滅菌時(shí)間計(jì)算：例3-1連續(xù)滅菌時(shí)間計(jì)算：t=（2.303/k）×lnN0/Nt

式中N0、Nt分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前后菌數(shù)培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第25頁(yè)二、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌計(jì)算與操作連續(xù)滅菌又稱為連消，即在一套專門滅菌設(shè)備中，培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)料、瞬時(shí)升溫、短時(shí)保溫、盡快降溫過(guò)程。培養(yǎng)基滅菌醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第26頁(yè)七、分批滅菌與連續(xù)滅菌比較連續(xù)滅菌優(yōu)點(diǎn)：1、可采取高溫短時(shí)，培養(yǎng)基破壞少；2、發(fā)酵罐利用率高；3、蒸