血清蛋白的分離

血清蛋白的分離第1頁(yè)/共26頁(yè)聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N—甲叉雙丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)就能聚合。引發(fā)自由基團(tuán)的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種?；瘜W(xué)法的引發(fā)劑是過硫酸胺（Ap），催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自由基團(tuán)。實(shí)驗(yàn)原理第2頁(yè)/共26頁(yè)聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠體系有連續(xù)和不連續(xù)電泳之分。不連續(xù)電泳系統(tǒng)由濃縮膠和分離膠兩種膠體組成，兩種膠體分別由不同的pH的緩沖液和膠貯液配制而成，形成孔徑不同的兩種膠體。不連續(xù)電泳系統(tǒng)電泳分離過程中包括三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)和凝膠的分子篩效應(yīng)。本次試驗(yàn)采用不連續(xù)電泳系統(tǒng)PAGE，通過三種效應(yīng)將血清中各蛋白質(zhì)組分按其分子大小、電荷多少不同進(jìn)行分離。第3頁(yè)/共26頁(yè)聚丙烯酰胺凝膠電泳有圓盤電泳和垂直板電泳之分，但兩者的原理完全相同，只是所用的電泳槽不同。由于時(shí)間問題，本次試驗(yàn)將分兩組進(jìn)行，一組使用圓盤，一組使用垂直板。第4頁(yè)/共26頁(yè)夾心式垂直板電泳槽，圓盤電泳槽，電泳儀，直流穩(wěn)壓電源，玻璃板（13×13），注射器及微量注射器抽氣泵，干燥器，培養(yǎng)皿，玻璃棒，吸量管，燒杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，濾紙，日光燈實(shí)驗(yàn)儀器第5頁(yè)/共26頁(yè)制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑：

凝膠緩沖液，分離膠貯存液，0.8%過硫酸銨；

濃縮膠緩沖液，濃縮膠貯存液，40%蔗糖溶液，核黃素。Tris-甘氨酸電極緩沖液（PH8.3）已加入溴酚藍(lán)指示劑的血清樣品染色液（氨基黑）1%瓊脂（糖）溶液脫色液（7%乙酸溶液）由學(xué)生自己配制實(shí)驗(yàn)試劑第6頁(yè)/共26頁(yè)一、垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳1.凝膠的制備：（1）安裝夾心式電泳槽

將長(zhǎng)短玻璃板分別插到U形硅橡框的凹形槽中（注意勿用手接觸灌膠面的玻璃），在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠橡框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂糖且兩玻璃板內(nèi)下端處處有瓊脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂中應(yīng)避免有氣泡），瓊脂凝固后，將硅膠橡框裝入電泳槽內(nèi)，以對(duì)角線的方式將螺絲帽旋緊。實(shí)驗(yàn)步驟第7頁(yè)/共26頁(yè)

試劑名稱

用量（ml)

分離膠緩沖液（ph8.9）2.5ml分離膠凝膠貯液5.0ml

蒸餾水2.5ml將以上三種試劑混合均勻后，置于真空干燥器中

抽氣10min過硫酸銨，置于真空干燥器中，抽氣10min10.0ml

（2）分離膠的制備第8頁(yè)/共26頁(yè)按上表格配膠，二者抽氣后混合均勻，小心不要在溶液中攪出氣泡，以免過多接觸空氣。迅速用滴管將混合后的分離膠裝在二塊玻璃板之間至短板上端約3-4cm，并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠形成時(shí)有一水平面，（注意加水時(shí)，不要引起膠面的大波動(dòng)）。在室溫中放置，當(dāng)兩界面出現(xiàn)不同折射率時(shí)表明已凝膠，時(shí)間大約40分鐘，以出現(xiàn)折射率不同的界面為準(zhǔn)，再室溫下放置十分鐘，使凝膠充分。將分離膠上層的水倒去，再用濾紙吸去多余的水（注意不要碰破膠面），為下一步做準(zhǔn)備。第9頁(yè)/共26頁(yè)試劑名稱用量（ml)

濃縮膠緩沖液（ph6.7)0.5ml

濃縮膠貯液1.0ml40%蔗糖2.0ml將以上三種試劑混合均勻后，置于真空干燥器中，

抽氣10min

核黃素0.5ml

(3)濃縮膠制備：第10頁(yè)/共26頁(yè)按上表所示配膠，抽氣后加核黃素0.5ml,混勻，立即加入到已配制好的分離膠上面至短玻璃板上端約0.5cm，插入加樣梳，放于日光燈下10分鐘左右濃縮膠就開始凝膠，30~50分鐘左右凝好（凝縮膠變?yōu)槿榘咨珵闇?zhǔn)），凝好后小心拔去加樣梳。第11頁(yè)/共26頁(yè)將Tris—甘氨酸電極緩沖液稀釋10倍后倒入電泳裝置的左、右槽中，短玻板一側(cè)要稍微超過玻板，長(zhǎng)玻板一側(cè)只要越過電泳絲的高度。用微量注射器通過緩沖液在每個(gè)加樣凹槽中加入約5ul的樣品。2.加樣第12頁(yè)/共26頁(yè)將樣品端(短玻璃的一邊)接直流穩(wěn)壓電泳儀的負(fù)極，接通冷卻水，開始電泳。開始時(shí)電流控制在10mA，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至30mA左右。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣瓊脂界面處0.5cm左右時(shí)，電泳完成。將緩沖液回收至試劑瓶中，還可用1-2次（注意將正負(fù)級(jí)的緩沖液分開回收）。3.電泳第13頁(yè)/共26頁(yè)4.剝膠

將固定螺絲旋松，取出硅橡膠框，將一塊玻璃板輕輕剝開，然后用玻璃棒將膠板取下放入培養(yǎng)皿中。5.固定，染色

在培養(yǎng)皿中倒入氨基黑染色液至覆蓋膠板，染色分鐘左右，此時(shí)染色與固定同時(shí)進(jìn)行。（染色液要回收利用）6.脫色

用7%乙酸浸泡數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫去。第14頁(yè)/共26頁(yè)1.凝膠的制備：（1）安裝圓形玻管

將洗凈的玻璃管烘

干后用橡膠玻璃頭封

嚴(yán)，放置在一邊等待灌膠。二圓盤聚丙酰胺凝膠電泳第15頁(yè)/共26頁(yè)

(2)分離膠制備

按垂直板的方案進(jìn)行配膠，混勻后迅速用滴管分裝在玻璃管中至玻璃管上端約2-3cm，并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠形成時(shí)有一水平面，在室溫中放置，當(dāng)兩界面出現(xiàn)不同折射率是表明已凝膠，將分離膠上層的水倒去，再用濾紙吸去多余的水（注意不要碰破膠面），為下一步做準(zhǔn)備。(3)濃縮膠制備（同垂直板）：按垂直板的方案進(jìn)行配制，配制好后，立即加入到已配制好的分離膠上面至短玻璃板上端約1cm，然后放于日光燈下10分鐘左右濃縮膠就開始凝膠，30~50分鐘左右凝好（凝縮膠變?yōu)槿榘咨珵闇?zhǔn)）。第16頁(yè)/共26頁(yè)2.加樣將電極緩沖液稀釋10倍后倒入電泳裝置的上.下槽中（注意需沒過玻璃管的上下端），用微量注射器通過緩沖液在每個(gè)玻璃管的凝膠表面加約5ul的樣品3.電泳將樣品端(上槽)接直流穩(wěn)壓電泳儀的負(fù)極，下槽接直壓電泳儀的正極。開始時(shí)電流控制在1-2mA/管，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至5mA左右/管。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離玻璃管下緣1-2cm左右時(shí)，停止電泳。將緩沖液回收至試劑瓶中（注意正負(fù)極分開回收）。第17頁(yè)/共26頁(yè)4.剝膠將玻璃管從電泳槽中取下，用注射器吸滿自來水后將針頭插到凝膠與管壁之間，推動(dòng)注射器，使針頭在管壁和膠之間前進(jìn)，膠條在水的壓力及潤(rùn)滑的作用下自玻管中脫出，將其放入培養(yǎng)皿中。5.固定，染色，脫色（同垂直板）第18頁(yè)/共26頁(yè)由于與凝膠集合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；剝膠時(shí)凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格地清洗。安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。用瓊脂（糖）封底及灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過。注意事項(xiàng)第19頁(yè)/共26頁(yè)灌膠時(shí)，若擔(dān)心瓊脂封底不牢固，則可在上、下貯槽中倒入蒸餾水，液面上面不能超過上貯槽的短玻璃板，防止蒸餾水進(jìn)入凝膠中。其作用是增加壓力，防止凝膠液滲漏。濃縮膠凝膠完全聚合后，必須放置30min左右，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品槽模板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后扭曲（凝膠加“老化”整個(gè)過程用時(shí)大約50分鐘）。電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)。注意事項(xiàng)第20頁(yè)/共26頁(yè)電泳后，應(yīng)分別收集上、下貯