血液樣本采集和血涂片制備

血液樣本采集和血涂片制備第1頁(yè)/共49頁(yè)（一）血液的組成血液由（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板）和血漿組

成血漿：血液加抗凝劑后分離出的淡黃色液體血清：離體后的血液自然凝固析出的淡黃色透

明液體血漿與血清的區(qū)別：

血清缺少某些凝血因子，如：凝血因子Ⅰ（纖維蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ等。一、血液生理概要第2頁(yè)/共49頁(yè)第3頁(yè)/共49頁(yè)（二）血液的理化性質(zhì)血量：成人約4-5L，約占體重的6%-8%，

血漿占55%，血細(xì)胞45%顏色：紅色，動(dòng)脈呈鮮紅色，靜脈血呈暗紅色。嚴(yán)重貧血者

紅色變淺。一氧化碳或氰化物中毒者血液呈櫻紅色酸堿度：成人PH7.3～7.45，動(dòng)脈血PH7.40靜脈血pH7.35比密和滲透量：男性約1.055～1.063，女性約1.051～1.060

相對(duì)粘度為4～5；血漿比密約1.025～1.030。

血液比密與紅細(xì)胞含量、紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量有關(guān)

血漿比密與血漿內(nèi)血紅蛋白有關(guān)。血漿滲透量:約290～310mOsm／kg﹒H?O第4頁(yè)/共49頁(yè)

(三)血液特性

懸浮穩(wěn)定性紅細(xì)胞在血漿中的懸浮穩(wěn)定性

均勻混懸狀態(tài)

粘滯性全血粘度為生理鹽水的4～5倍，血漿粘度為生理鹽水的1.6倍左

右

凝固性血液從血管中流出可自行凝固（四）血液生理功能

運(yùn)輸功能協(xié)調(diào)功能

維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定防御功能

第5頁(yè)/共49頁(yè)二、采血方法（一）靜脈采血法

1、采血部位：肘部靜脈、手背靜脈、內(nèi)踝靜脈

或股靜脈

小兒可采頸外靜脈血液

第6頁(yè)/共49頁(yè)2、操作方法：

準(zhǔn)備試管檢查注射器選擇靜脈

消毒扎壓脈帶穿刺

抽血放血與混勻

第7頁(yè)/共49頁(yè)3、注意事項(xiàng)：

（1）采血前應(yīng)向患者耐心解釋，以消除疑慮和

恐懼心理

（2）

所用針頭應(yīng)銳利、光滑、通氣、針筒不漏氣

若靜脈暴露不明顯，可用左手食指消毒后，

觸摸采血部位，發(fā)現(xiàn)靜脈后憑手感的方向性

穿刺

（3）抽血時(shí)只能往外抽，不能往里推第8頁(yè)/共49頁(yè)（二）皮膚采血法：1、概述：

又稱為毛細(xì)血管采血法，是采集微動(dòng)脈、微靜脈和毛細(xì)血管的混合血，同時(shí)含細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)液。

采血部位：世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦采集左手

無(wú)名指指端內(nèi)側(cè)血液，嬰幼兒可采集大踇趾或足跟內(nèi)側(cè)緣血液，嚴(yán)重?zé)齻颊?，可選擇皮膚完整處采血。

目前可用激光無(wú)痛采指血儀采血。第9頁(yè)/共49頁(yè)2、操作方法：

準(zhǔn)備取合適試管，加適量稀釋液

取微量試管與乳膠吸頭相連并檢查是否漏

氣，或取一次性微量采血管

按摩按摩左手中指或無(wú)名指指端內(nèi)側(cè)，使局部

組織充血消毒用75%的乙醇棉簽擦拭采血部位，待干第10頁(yè)/共49頁(yè)針刺左手捏緊采血指端，右手持一次性消毒采血

針自指端腹內(nèi)刺入，深度2～3mm拭血血液流出后，用無(wú)菌棉球擦去第一滴血吸血用一次性微量吸管吸血，止血。若血流不

暢，可用左手自采血部位遠(yuǎn)端向指端施壓

使血液流出

第11頁(yè)/共49頁(yè)稀釋用無(wú)菌干棉球擦去吸管外部血液，將吸管伸

入裝有稀釋液的試管底部，慢慢排試管內(nèi)的

出血液，并用上清液清洗管內(nèi)余血2～3次，

最后將試管內(nèi)的血液混勻第12頁(yè)/共49頁(yè)3、注意事項(xiàng)（1）所選采血部位皮膚應(yīng)完整，無(wú)燒傷、凍瘡、發(fā)紺水腫或炎癥，除特殊情況外，不要耳垂采血（2）應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止采血部位感染，做到一人一針一管，避免交叉感染。（3）消毒后，待乙醇揮發(fā)后采血，否則流血不易成滴（4）因第一滴血混有組織液，應(yīng)擦去，應(yīng)向結(jié)果的準(zhǔn)確性

第13頁(yè)/共49頁(yè)（三）真空采血法：

真空采血裝置有套筒式、頭皮靜脈式兩種。封閉式采血避免了容器之間的轉(zhuǎn)移，減少溶血現(xiàn)象，能有效保護(hù)血液有形成分，保證待檢樣本原始性狀的完整性，是檢驗(yàn)結(jié)果更可靠。能有效避免醫(yī)護(hù)人員與患者之間的交叉感染。各種真空采血容器根據(jù)需要標(biāo)有不同的色碼，適用于不同檢驗(yàn)項(xiàng)目（表1-1-1）。第14頁(yè)/共49頁(yè)第15頁(yè)/共49頁(yè)（四）方法學(xué)評(píng)價(jià)1、皮膚采血法：

缺點(diǎn)易溶血、凝血、混入組織液，局部皮膚揉擦、刺針深度不一等影響檢驗(yàn)結(jié)果；結(jié)果重復(fù)性差、準(zhǔn)確性不好2、

靜脈采血法：

開(kāi)放式采血法，操作環(huán)節(jié)多、難于規(guī)范、易造成血液污染；封閉式采血法，操作規(guī)范，利于樣本運(yùn)送和保存，防止院內(nèi)血源性傳染病。第16頁(yè)/共49頁(yè)（五）質(zhì)量控制

1、患者患者活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、藥物等會(huì)影

響檢測(cè)結(jié)果

2、采血止血帶結(jié)扎應(yīng)＜1min

3、溶血容器不潔凈、劇烈震蕩、操作不當(dāng)引起

溶血使血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿、血清化學(xué)成

分改變等多項(xiàng)指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)生變化第17頁(yè)/共49頁(yè)

4、樣本處理

采血后立即送檢，標(biāo)本保存不當(dāng)直接影響檢驗(yàn)

結(jié)果5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

應(yīng)考慮藥物、飲食等因數(shù)對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)密

切結(jié)合臨床第18頁(yè)/共49頁(yè)三、抗凝劑的選擇抗凝：

是用物理或化學(xué)的方法除去或抑制血液中的

某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固?？鼓齽┗蚩鼓镔|(zhì)：

能夠阻止血液凝固的物質(zhì)

常用的抗凝物質(zhì)如下：第19頁(yè)/共49頁(yè)

1、乙二胺四乙酸（EDTA）鹽

鈉鹽（EDTA﹒Na?H?O）鉀鹽（EDTA﹒K?H?O），能與血液中的鈣離子結(jié)合成螯合物，使鈣離子失去凝血作用，阻止血液凝固。其有效抗凝濃度為1～2mg/ml血液。

血細(xì)胞分析儀用EDTA-K2作抗凝劑，用量為EDTA-K2?2H2O1.5～2.2mg/ml血液第20頁(yè)/共49頁(yè)

2、草酸鹽

草酸根離子能與樣本中的鈣離子形成草酸鈣沉淀，使鈣離子失去作用，阻止血液凝固。草酸鹽：

溶解度好、廉價(jià)，但對(duì)凝血因子Ⅴ的保護(hù)作用差，影響凝血酶原時(shí)間測(cè)定，因此草酸鹽不適用于凝血檢查。第21頁(yè)/共49頁(yè)

3、草酸鹽雙草酸鹽：

不影響紅細(xì)胞形態(tài)和體積，可用于血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)可使血小板聚集、影響白細(xì)胞形態(tài)，不適用于血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類數(shù)第22頁(yè)/共49頁(yè)

4、肝素加強(qiáng)抗凝血酶（AT）滅活絲氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，從而阻止血液凝固。肝素具有抗凝力強(qiáng)、不影響紅細(xì)胞體積、不易溶血等優(yōu)點(diǎn)，絕大都數(shù)檢查都可用肝素做抗凝劑，是紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)的的理想抗凝劑。可影起白細(xì)胞聚集瑞，氏染色后產(chǎn)生藍(lán)色背景，不適用于CBC、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查第23頁(yè)/共49頁(yè)

5、枸櫞酸鹽常用有枸櫞酸鈉，能與血液中的鈣離子結(jié)合形成螯合物，阻止血液凝固。

應(yīng)用范圍：血沉、凝血象、血小板功能檢查及血

液保養(yǎng)液。

凝血:109mmol/L水溶液,與血液之比為1:9；

血沉:106mmol/L水溶液,與血液之比為1:4。第24頁(yè)/共49頁(yè)四、血液涂片制備（一）載玻片的清潔1.新玻片1mol/LHCl泡24小時(shí)→水洗→干燥。

2.舊載玻片肥皂水或其他合成洗滌劑水中煮沸20分鐘→熱水洗→自來(lái)水洗→干燥。(→95%乙醇泡1小時(shí)→蒸餾水洗→干后備用)。第25頁(yè)/共49頁(yè)（二）血涂片的制備方法1.取血滴。2.散開(kāi)血滴。3.推片。4.干燥第26頁(yè)/共49頁(yè)1、手工推片法：

取血液一滴，置于載玻片一端．以邊緣平滑的推片（推片兩端應(yīng)平整光滑，比載玻片稍窄或磨去兩角）的一端，放在血滴前方，逐漸后移接觸血滴，血液立即沿推片散開(kāi)。第27頁(yè)/共49頁(yè)1、手工推片法：將推片與載片保持30°-45°夾角，平穩(wěn)向前推進(jìn)至載玻片的另一端，殘片上即留下一薄層血膜。第28頁(yè)/共49頁(yè)1、手工推片法：血膜的影響因素

1.血滴大小、

2.推片與載玻片之間的角度、

3.推片時(shí)的速度有關(guān)。血滴愈大、角度愈大、推片時(shí)速度愈快，

則血膜愈厚；反之血膜愈薄。第29頁(yè)/共49頁(yè)2、厚血膜涂片法載玻片中央置血1滴鏡檢

↓↑用推片角將血由內(nèi)向外旋染色轉(zhuǎn)涂成厚薄均勻、直徑約↑1.5cm的圓形血膜待干

↓↑待干→加蒸餾水使紅細(xì)胞溶解→待干鏡第30頁(yè)/共49頁(yè)一張良好的血涂片的要求

厚薄適宜頭體尾分明細(xì)胞分布均勻血膜邊緣整齊，并留有一定空隙第31頁(yè)/共49頁(yè)五、血液細(xì)胞染色（一）瑞氏染色法瑞氏染液是有酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料溶于甲醇而成。甲醇的作用：溶解亞甲藍(lán)和伊紅

固定細(xì)胞形態(tài)第32頁(yè)/共49頁(yè)1、染色原理伊紅系不易解離的弱酸性染料，通常用伊紅鈉鹽（Ｎａ+Ｅ－），其有色部分是伊紅，為陰離子，所以伊紅是酸性染料。第33頁(yè)/共49頁(yè)1、染色原理

【原理】

美藍(lán)又名亞甲藍(lán)，為四甲基硫堇染料，有對(duì)醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)，通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)（Ｍ+ＣＩ-）。其有色部分是美藍(lán)，為陽(yáng)離子，所以是一種堿性染料。

第34頁(yè)/共49頁(yè)1、染色原理

【原理】

細(xì)胞的受色既有化學(xué)親和作用，也有物理吸附作用。細(xì)胞中的嗜酸性物質(zhì)（如血紅蛋白、嗜酸性顆粒）易與酸性染料伊紅結(jié)合，染成粉紅色；細(xì)胞中的嗜堿性物質(zhì)（如核染色質(zhì)、嗜堿性顆粒）易與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染成藍(lán)色；中性顆粒呈等電狀態(tài)，與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫紅色。第35頁(yè)/共49頁(yè)2、PH對(duì)細(xì)胞染色的影響

1.在酸性環(huán)境中，染色偏紅；

2.在堿性環(huán)境中,染色偏藍(lán)。染色時(shí)應(yīng)用pH6.4～6.8的緩沖液維持恒定的酸堿環(huán)境。第36頁(yè)/共49頁(yè)3、試劑調(diào)配（1）Ⅰ液：瑞氏染料1.0g、純甲醇（AR級(jí)以上）600ml、甘油15ml。染料放入清潔干燥的乳缽中，加入少量甲醇慢研30min以上，將充分溶解的染料后倒入潔凈的棕色瓶?jī)?nèi)，乳缽內(nèi)再加入少許甲醇細(xì)研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止，最后加入15ml甘油，密封保存。第37頁(yè)/共49頁(yè)試劑調(diào)配（2）Ⅱ夜：磷酸鹽緩沖液（PH6.4～6.8）由磷酸二氫鉀（KH?PO?）0.3g、磷酸氫二鈉（Na?HPO?）0.2g、蒸餾水加至1000lm。配好

后用磷酸鹽溶液矯正pH，塞緊瓶口保存。第38頁(yè)/共49頁(yè)4、染色方法采血在距離載玻片一端1cm處加血液1滴血液。推片左手拿載玻片，右手持推片，制成舌狀、頭、

體、尾分明的血涂片。干燥在空氣中晃動(dòng)，使其快速干燥，天氣寒冷或

潮濕時(shí)，可置37℃溫箱中保溫促干。標(biāo)記在載玻片一端做好標(biāo)記。第39頁(yè)/共49頁(yè)4、染色方法染色將血涂片平置于染色架上，滴加Ⅰ夜3～5滴

使其迅速蓋滿血涂片，約0.5～1min后，滴加等量或稍多的Ⅱ夜，用吸球吹氣，使染料充分混合。沖洗5～10min后用流水洗去染液，待干鏡檢。第40頁(yè)/共49頁(yè)5、注意事項(xiàng)（1）血涂片干透后固定，否則細(xì)胞在染色過(guò)程中容

易脫落。（2）加染料應(yīng)適量，過(guò)少易蒸發(fā)形成沉淀，使細(xì)胞

不易檢查。（3）不能先倒染料，以防染料沉著在血涂片上。沖

洗時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以防脫色。（4）染色過(guò)淡可以復(fù)染，復(fù)染時(shí)應(yīng)先加緩沖液，后

加染液。第41頁(yè)/共49頁(yè)（二）吉姆薩染色法1、染色原理

吉姆薩染液由天青、伊紅組成。染色原理和結(jié)

果與瑞氏染色基本相同第42頁(yè)/共49頁(yè)2、試劑配制吉姆薩染料1.0g、甘油66ml、甲醇66ml。

將染料倒入盛有66ml甘油的圓錐燒瓶?jī)?nèi)，在56℃水浴鍋上加熱90～120m